背景介绍

实时荧光定量PCR（Quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）技术是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，通过阈值循环数（Ct值）结合标准曲线（绝对定量）或内参基因归一化（相对定量），精确计算样本中靶基因的初始拷贝数或表达水平。目前最常见的方法是荧光探针法和荧光染料法。荧光探针法，使用荧光标记的特异性探针与目标序列结合，如TaqMan®；荧光染料法，使用荧光染料（如SYBR Green）嵌入双链DNA中，随着PCR产物的增加，荧光信号增强，如SYBR® Green荧光染料。

2016年qRT-PCR技术被欧美等国收录进入药典，成为生物药宿主核酸残留检测方法之一。实时荧光定量PCR 能够专一，灵敏，快速，高重复地准确定量起始模板的浓度，可用于mRNA 表达量水平检测、microRNA 表达量水平检测和基因拷贝数检测。qPCR所使用的荧光化学试剂可分为两种：荧光染料和荧光探针。

卡梅德生物提供高品质的荧光定量PCR服务，可为您量身定制目标引物和特定序列的探针设计。我们拥有多种规格和类别，不断优化试验设计以满足客户不同的研究需求，为您的RT-PCR荧光定量应用提供支持。

图1.SYBR荧光染料法；TaqMan探针法（http://ionegun.blog.163.com/blog/static/127913469201053115850999/）

服务内容

卡梅德生物（KMD Bioscience）多年来致力于分子生物学领域研究。利用分子生物学技术手段，基于丰富的研究经验，卡梅德生物能够为客户提供SYBR Green 法和TaqMan探针法对 DNA/RNA 进行定性与定量的检测分析，例如使用荧光定量PCR可以检测不同的样品中的某一基因的含量变化。基于完善的分子生物学和免疫学检测试验平台，我们能够为客户提供一站式分子杂交服务，包括Q-PCR，斑点杂交实验，免疫印迹等服务。

 服务流程 

送样要求

RT-qPCR荧光定量服务常见问题解答

1.我该如何处理扩增曲线？

答：实时PCR仪器输出扩增曲线，显示荧光信号（RFU）与循环数的关系，反映产物积累。曲线分为三部分：基线期产物少，信号低于背景；指数期产物迅速增加；半对数图能更清晰展示指数阶段。

2.扩增阈值是多少？

答：扩增阈值是根据组中所有曲线基线区域的背景荧光计算得出的。阈值代表报告信号明显高于背景水平的点。

3.一步法和两步法 RT-qPCR 有什么区别？

答：区别在于 RT 步骤是与 PCR 分开进行还是在同一试管中进行。一步式 RT-PCR法中，RT 和 PCR 步骤在同一试管中按顺序进行，使用全部 cDNA 合成产物作为 PCR 模板。两步式 RT-PCR中，RT和PCR步骤也是按顺序进行的，但只有一部分 cDNA 产物用作 PCR模板，PCR在单独的试管中进行。