当细胞内产生DSBs双链片段时，细胞启动同源末端定向修复（HDR）和非同源末端连接（NHEJ）两种机制进行修复，真核生物主要依赖于HDR（需提供同源DNA片段）和NHEJ（不需提供同源片段）两种修复途径，而原核生物主要依赖于HDR进行修复。NHEJ途径只存在于少数细菌中，多数细菌依赖于HDR途径完成修复。基于CRISPR-Cas9的基因编辑在原核生物中被广泛使用，引入外源DNA片段时可实现基因的插入、缺失、突变。大肠杆菌因其遗传背景清楚、技术操作简单、培养条件简单等优点，而作为基因编辑研究中常用的模式生物。毕赤酵母具有生长速度快、高密度发酵、易于遗传改造等优点，适用于生产需要修饰以及在原核系统中难以表达的蛋白。

表1.微生物基因编辑种类

基于CRISPR/Cas9技术的微生物基因敲除体系的建立，包括sgRNA设计、载体构建及转化、转化子筛选和分子鉴定等步骤。

λ-Red同源重组法，需设计同源臂序列并构建敲除载体；将同源臂序列及载体转染宿主菌；在Red重组酶的作用下，敲除载体与目标基因发生同源重组反应，导致目标基因被抗性基因所替代。最终，通过抗性基因的选择性富集，实现对敲除菌株的筛选。

1.细菌基因敲除有哪些方法？

答：基于Red的同源重组法和CRISPR/Cas9技术。Red酶介导的基因敲除，需要消除菌株的抗性基因。而CRISPR/Cas9方法则能实现无痕敲除，即不残留抗性或重组位点，同时消除外源质粒。

2.细菌基因敲除有哪些应用？

答：品种改良、疾病机理研究、免疫应用、精准医疗（遗传病的靶向治疗）、抗生素的研发、工业用酶的发现及微生物发酵行业等。

3.细菌基因敲除实验流程？

答：构建CRISPR/Cas系列载体、转化感受态宿主菌、筛选和验证基因敲除菌株、菌株保存。