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TA克隆及RACE技术简介

2025-08-15
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背景介绍


TA克隆就是把PCR片段与一个具有3' -T突出的载体DNA连接起来的方法。该方法利用Taq聚合酶具有末端转移酶(TdT)活性,但却不具有3'-5'端外切酶校准活性的特点,可在PCR产物的3' 端加上一个非模板依赖性碱基"A"。例如:Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能,PCR反应时在每条PCR扩增产物的3'端自动添加一个3'-A突出端。只有用经过特殊处理的具有3'-T突出末端的DNA片段才能通过T/A配对进行连接。通过PCR的方法扩增目的基因片段的过程中,由于往往不清楚目的基因的DNA序列,获得的目的片段通常需要通过TA克隆的方法,重组到T-载体中,通过序列测定清楚DNA序列。

cDNA末端快速扩增技术(RACE),是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。是基于PCR技术由已知的一段cDNA片段,利用锚式PCR,快速扩增cDNA末端从而获得已知mRNA内一段小序列与3'或5'的cDNA序列技术。


服务内容 


 卡梅德生物(KMD Bioscience)从事分子生物学研究多年,我们的分子生物学平台拥有高学历和分子生物学操作经验丰富的技术人员,可为您提供专业的分子生物学实验服务。卡梅德生物的科学家可根据客户的具体需求提供TA克隆服务及RACE 技术服务,以满足客户的需求。

 


服务内容

周期(工作日)

TA克隆

片段长度<1000bp<>

5-8日

3'RACE

片段长度<1000bp<>

2-3

5'RACE

片段长度<1000bp<>

2-3

备注:片段超出1kb的克隆服务,具体情况还需与我们专业的技术同事联系



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图1.A 3′RACE扩增流程;B 5′RACE扩增流程

 


样本要求


服务内容

样本要求

TA克隆服务

纯化后的PCR产物(需使用Taq酶扩增,确保3'端带有A尾)。

RACE技术服务

总RNA或mRNA(≥500 ng/ul;OD260/230>2.0)

 



TA克隆及RACE技术服务常见问题解答

1. 什么是无缝克隆技术?

答:In-Fusion 克隆是一种高效、不依赖连接的克隆方法,基于克隆插入物和线性化克隆载体互补末端的退火。该技术可确保轻松、一步定向克隆任何感兴趣的基因到任何载体的任何位置。In-Fusion 构建体是无缝的,可实现翻译阅读框架连续性,而不会产生任何干扰性“疤痕”序列。

2. 无缝克隆的机制?

答:无缝克隆利用DNA片段的同源末端与载体末端的同源序列进行重组,实现精确连接。基本步骤包括:设计重叠序列、酶切与线性化、重组反应等。关键是利用重组酶,其能识别同源序列并催化重组反应。

3.PCR生成的3' A突出端会干扰融合克隆吗?

答:不会,3' A突出不会干扰In-Fusion克隆机制。

         4.TA克隆失败可能原因

          答:可能的原因:PCR产物无A尾(使用错误聚合酶)、纯度不足或浓度过低。解决方案:胶回收纯化,更换Taq酶重新扩增。

5.RACE无结果的可能因素

答:RNA降解或污染导致反转录失败;引物设计不当(需优化退火温度或嵌套引物)。

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