Q1：CRISPR/Cas9与TALEN、ZFN等传统基因编辑技术相比，核心优势是什么？

A1：CRISPR/Cas9的核心优势集中在易用性、成本和灵活性上。TALEN和ZFN需针对每个靶点设计特定蛋白质结构，设计周期长且成本高；而CRISPR仅需合成20bp左右的sgRNA序列，1-2天即可完成设计，成本仅为前两者的1/10-1/5。

此外，CRISPR 支持多靶点同时编辑，可通过一次转染导入多个 sgRNA，实现多基因协同编辑；而TALEN和ZFN多靶点编辑时易出现蛋白质间干扰，效率大幅下降。

Q2：CRISPR编辑后的细胞系，如何验证编辑是否成功且未引入非预期突变？

A2：需通过 “靶向验证 + 全基因组筛查” 两步验证。靶向验证常用3种方法：

（1）PCR扩增目标区域后进行Sanger测序，直接确认编辑位点是否出现预期突变（如插入 / 缺失、敲入序列）。

（2）Surveyor assay，通过酶切识别错配的DNA双链，检测编辑效率。

（3）Western blot或流式细胞术检测目标基因的蛋白表达变化，确认功能是否受影响。

全基因组筛查则针对脱靶风险，常用全基因组测序（WGS）或靶向捕获测序，对比编辑前后细胞的基因组序列，排查是否在非目标区域出现随机突变；若预算有限，也可通过生物信息学预测高风险脱靶位点，再针对性进行 PCR 测序验证。

Q3：在编辑干细胞（如胚胎干细胞、诱导多能干细胞）时，CRISPR/Cas9会面临哪些特殊挑战？

A3：干细胞编辑的核心挑战集中在干性维持和嵌合率控制。

首先，干细胞对转染条件敏感，病毒递送可能激活细胞凋亡通路，导致干细胞死亡或分化；非病毒递送则面临效率低的问题，部分干细胞（如神经干细胞）的细胞膜屏障性强，sgRNA和Cas9难以进入。

其次，干细胞分裂活跃，若编辑未在G2/M期（HDR 效率较高的时期）完成，易出现 “嵌合编辑”—— 同一细胞群中部分细胞编辑成功、部分未编辑，后续单克隆筛选难度增加。

此外，编辑后的干细胞需验证干性标志物（如Oct4、Sox2）的表达，避免因编辑过程导致干性丢失，影响后续分化应用。

Q4：CRISPR/Cas9能否编辑基因组中的非编码RNA区域（如 miRNA、lncRNA、增强子）？编辑这类区域的难点是什么？

A4：可以，且是当前研究热点之一。

非编码RNA区域编辑的主要目的是调控基因表达，比如编辑miRNA基因可影响其靶向的下游mRNA，编辑增强子可改变其调控的靶基因转录活性。但这类编辑存在两大难点：

（1） 靶点设计难度高：非编码区域无明确 “外显子” 等特征序列，需通过生物信息学预测功能区域（如增强子的核心结合位点），否则编辑可能无明显功能变化；

（2）脱靶风险高：非编码区域序列保守性低于编码区，sgRNA易与其他非编码区域结合，且非编码区突变的影响更难预测（如可能间接调控多个基因），需结合转录组测序（RNA-seq）分析编辑后的整体基因表达变化。

Q5：长期培养CRISPR编辑后的细胞系，是否会出现基因组稳定性下降的问题？如何规避？

A5：可能会。长期培养（通常超过 20 代）中，编辑后的细胞可能因以下原因出现稳定性问题：

（1）编辑位点存在 “微同源序列”，长期分裂中易发生二次重组，导致片段缺失或重复。

（2）编辑过程激活的DNA修复通路，可能在后续分裂中持续处于活跃状态，增加随机突变概率。

（3）部分编辑（如敲除抑癌基因）可能间接促进细胞增殖异常，加速基因组变异。

规避方法包括：

（1）选择 “中性位点” 进行编辑（如基因组中无重要功能的间隔区），减少编辑位点对基因组稳定性的影响。

（2）定期对细胞系进行 “基因组指纹鉴定”（如短串联重复序列检测）和目标区域测序，监测是否出现变异。

（3）控制培养条件，避免过度传代，同时使用无血清、化学成分明确的培养基，减少外界刺激对基因组的影响。