CRISPR/Cas9技术是具有革命性意义的基因编辑技术，这一技术体系最初源自细菌的适应性免疫机制，经科研人员工程化改造后，可在真核细胞内完成基因组的精准定位与切割操作，并为基因功能研究和疾病模型构建提供了强有力的技术支撑。

一、CRISPR/Cas9技术原理与工作机制

CRISPR/Cas9系统的核心由两个部分组成：引导RNA（sgRNA）和Cas9核酸酶。sgRNA通过约20个核苷酸的靶向序列识别特定基因组位点，将Cas9核酸酶精准引导至目标位置。其工作机制具有以下特点：

1. sgRNA通过碱基互补配对原则与目标DNA序列结合

2. Cas9核酸酶在PAM序列上游的特定位点切割DNA双链

3. 细胞通过两种主要修复机制响应DNA双链断裂

细胞针对这类DNA损伤具备两种主要修复机制：非同源末端连接是一种易错的修复方式，常常会造成插入或缺失突变，可用于实现基因敲除；同源定向修复需提供外源修复模板，可以实现特定基因的精准插入或替换。

在细胞系基因编辑领域，CRISPR/Cas9技术已经展现出巨大的应用价值。其中几个重要应用方向包括：基因敲除细胞系构建：通过设计针对特定基因外显子的gRNA，利用NHEJ修复途径引入移码突变；基因敲入与定点修饰：通过同源定向修复机制在基因组特定位点精确引入外源序列；疾病模型构建：创建用于研究人类疾病机制的CRISPR细胞系。

基因敲除技术是应用最广泛的手段之一。研究人员通常建议对每个靶点设计若干种不同的gRNA分子，并靶向早期组成型外显子区域，以提升成功概率。而CHO细胞系的构建过程中，借助CRISPR介导的HDR技术将治疗性蛋白相关基因精确导入基因组特定区域，达成稳定且高效的蛋白质表达效果。

图1  CRISPR-Cas9 系统的基因编辑机制

CRISPR细胞系是疾病模型构建领域研究人类疾病作用机制的关键工具。科研工作者运用CRISPR/Cas9技术在人类造血干细胞中成功模拟染色体易位现象，建立起研究白血病发生早期分子事件的模型体系。这类精心设计的CRISPR细胞系为深入理解血液系统恶性肿瘤发病机理提供了独特的研究平台。

二、CRISPR/Cas9技术优化与创新进展

随着CRISPR技术的广泛应用，研究人员不断优化编辑效率并拓展其功能。技术优化的主要方向包括：

1. 新型Cas9变体的开发：通过蛋白质工程技术改良编辑特性

2. 递送系统的优化：提高CRISPR组分进入细胞的效率

3. 脱靶效应的控制：确保基因编辑的精确性和安全性

新式 Cas9 突变体的研发是当下科研热点之一。科研人员借助蛋白质工程技术研制出多种带改良属性的Cas9突变体，例如拥有更强编辑效能与更广PAM识别区间的变体。递送体系的优化改进也是提高CRISPR基因编辑效能的核心要素，当前常用的递送方式包含病毒递送与非病毒途径，专业的CRISPR服务机构常会依据具体细胞种类和实验需求为客户推选最适配的输送方案。

科研人员为应对脱靶效应这一技术难题研发出各类策略：改良 gRNA设计、采用高保真Cas9突变体及调控CRISPR组分表达量等方法都能够切实减少脱靶的风险。此外，全基因组sgRNA文库筛选服务的问世让科研人员可更迅捷地辨别最有效的gRNA序列，显著提升了CRISPR细胞系构建的成功概率。

三、CRISPR/Cas9基因编辑应用前景

CRISPR/Cas9技术在细胞系编辑中的应用前景十分广阔，主要体现在以下领域：

⇒ 基础研究：基因功能鉴定和信号通路解析

⇒ 疾病建模：创建各种遗传性疾病模型，为药物筛选和治疗方法开发提供重要平台

⇒ 生物技术：开发高效表达治疗性蛋白的细胞系，推动生物制药产业的进步。

图2  CRISPR/Cas9服务主要应用范围

卡梅德生物为研究人员提供了全方位的技术支持。我们可提供从sgRNA设计验证到单克隆制备的一站式解决方案，可大大降低研究人员开展基因编辑项目的技术门槛。除了基因编辑细胞系以外，我们还提供多种CRISPR服务，如植物基因编辑、动物基因编辑以及微生物基因编辑等，为研究者们提供更加全面完善的服务。

参考文献

[1] Zhou W, Deiters A. Conditional Control of CRISPR/Cas9 Function. Angew Chem Int Ed Engl. 2016 Apr 25;55(18):5394-9.

[2] Bhattacharjee G, Gohil N, Khambhati K, et al. Current approaches in CRISPR-Cas9 mediated gene editing for biomedical and therapeutic applications. J Control Release. 2022 Mar;343:703-723.

[3] Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science.

[4] Cong L, Ran FA, Cox D, et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013 Feb 15;339(6121):819-23.

[5] Ronda C, Pedersen LE, Hansen HG, et al. Accelerating genome editing in CHO cells using CRISPR Cas9 and CRISPy, a web-based target finding tool. Biotechnol Bioeng. 2014 Aug;111(8):1604-16.

常见问题解答

Q1：CRISPR/Cas9与TALEN、ZFN等传统基因编辑技术相比，核心优势是什么？

此外，CRISPR 支持多靶点同时编辑，可通过一次转染导入多个 sgRNA，实现多基因协同编辑；而TALEN和ZFN多靶点编辑时易出现蛋白质间干扰，效率大幅下降。

Q2：CRISPR编辑后的细胞系，如何验证编辑是否成功且未引入非预期突变？

A2：需通过 “靶向验证 + 全基因组筛查” 两步验证。靶向验证常用3种方法：

（1）PCR扩增目标区域后进行Sanger测序，直接确认编辑位点是否出现预期突变（如插入 / 缺失、敲入序列）。

（2）Surveyor assay，通过酶切识别错配的DNA双链，检测编辑效率。

（3）Western blot或流式细胞术检测目标基因的蛋白表达变化，确认功能是否受影响。

全基因组筛查则针对脱靶风险，常用全基因组测序（WGS）或靶向捕获测序，对比编辑前后细胞的基因组序列，排查是否在非目标区域出现随机突变；若预算有限，也可通过生物信息学预测高风险脱靶位点，再针对性进行 PCR 测序验证。

Q3：在编辑干细胞（如胚胎干细胞、诱导多能干细胞）时，CRISPR/Cas9会面临哪些特殊挑战？

首先，干细胞对转染条件敏感，病毒递送可能激活细胞凋亡通路，导致干细胞死亡或分化；非病毒递送则面临效率低的问题，部分干细胞（如神经干细胞）的细胞膜屏障性强，sgRNA和Cas9难以进入。

其次，干细胞分裂活跃，若编辑未在G2/M期（HDR 效率较高的时期）完成，易出现 “嵌合编辑”—— 同一细胞群中部分细胞编辑成功、部分未编辑，后续单克隆筛选难度增加。

此外，编辑后的干细胞需验证干性标志物（如Oct4、Sox2）的表达，避免因编辑过程导致干性丢失，影响后续分化应用。

Q4：CRISPR/Cas9能否编辑基因组中的非编码RNA区域（如 miRNA、lncRNA、增强子）？编辑这类区域的难点是什么？

A4：可以，且是当前研究热点之一。

非编码RNA区域编辑的主要目的是调控基因表达，比如编辑miRNA基因可影响其靶向的下游mRNA，编辑增强子可改变其调控的靶基因转录活性。但这类编辑存在两大难点：

（1） 靶点设计难度高：非编码区域无明确 “外显子” 等特征序列，需通过生物信息学预测功能区域（如增强子的核心结合位点），否则编辑可能无明显功能变化；

（2）脱靶风险高：非编码区域序列保守性低于编码区，sgRNA易与其他非编码区域结合，且非编码区突变的影响更难预测（如可能间接调控多个基因），需结合转录组测序（RNA-seq）分析编辑后的整体基因表达变化。

Q5：长期培养CRISPR编辑后的细胞系，是否会出现基因组稳定性下降的问题？如何规避？

A5：可能会。长期培养（通常超过 20 代）中，编辑后的细胞可能因以下原因出现稳定性问题：

（1）编辑位点存在 “微同源序列”，长期分裂中易发生二次重组，导致片段缺失或重复。

（2）编辑过程激活的DNA修复通路，可能在后续分裂中持续处于活跃状态，增加随机突变概率。

（3）部分编辑（如敲除抑癌基因）可能间接促进细胞增殖异常，加速基因组变异。

规避方法包括：

（1）选择 “中性位点” 进行编辑（如基因组中无重要功能的间隔区），减少编辑位点对基因组稳定性的影响。

（2）定期对细胞系进行 “基因组指纹鉴定”（如短串联重复序列检测）和目标区域测序，监测是否出现变异。

（3）控制培养条件，避免过度传代，同时使用无血清、化学成分明确的培养基，减少外界刺激对基因组的影响。