抗菌肽（AMPs）是先天免疫系统的关键组成部分，也是水产动物抵御病原微生物侵染的核心防御物质。马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）是海水珍珠养殖领域的重要经济贝类，其先天免疫系统中组蛋白来源抗菌肽的相关研究可为贝类养殖病害防治提供重要理论依据与应用参考。

2023 年广东海洋大学研究团队在《Fish and Shellfish Immunology》发表的研究成果首次阐明了马氏珠母贝 H2A 组蛋白来源抗菌肽（PmH2A‑AMPs）的结构特征、抑菌活性及免疫应答机制。研究人员通过人工合成与结构优化获得了高活性抗菌肽衍生物并证实其通过破坏细胞膜结构实现抑菌功能，同时参与类中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）相关免疫应答过程，为水产用抗菌肽的开发与应用提供了全新研究方向与作用靶点。 

一、概述

本研究以马氏珠贝H2A组蛋白（PmH2A）为研究对象，针对马氏珠贝抗菌肽序列信息匮乏、功能机制不明的问题，开展了抗菌肽设计合成-体外抗菌活性-抗菌机制-体内免疫响应的全链条研究。研究团队基于蟾蜍素II（Buforin II）的序列特征，通过氨基酸替换、N端截短、基序重复改造，设计合成了3种PmH2A衍生抗菌肽：PmH2A-AMP、PmH2A-AMP (5-21)、PmH2A-AMP (5-13)[KLLK]3；采用微量肉汤稀释法测定了3种肽对7种革兰氏阳性/阴性菌的最小抑菌浓度（MIC），结合透射电镜（TEM）观察肽处理后细菌的形态学变化，明确了其抗菌机制为膜裂解；通过qRT-PCR和免疫组化（IHC）技术，分析了脂多糖（LPS）、肽聚糖（PGN）、聚肌苷酸-聚胞苷酸（Poly (I:C)）3种病原相关分子模式（PAMPs）刺激后，PmH2A在马氏珠贝血细胞和鳃组织中的时空表达规律，证实了LPS可诱导马氏珠贝释放抗菌组蛋白，产生类NETs免疫应答。

二、抗菌肽的膜裂解作用机制

通过TEM观察肽处理后细菌的形态变化，其中PBS对照组的副溶血性弧菌形态完整、胞质均匀，而PmH2A-AMP处理后的副溶血性弧菌细胞壁与细胞形态无明显变化，仅内膜出现破损、轻微凹陷且胞质分布不均，证实PmH2A-AMP 的抗菌作用靶点为细菌内膜，其通过破坏细菌内膜的完整性，导致膜的通透性改变，进而抑制细菌生长。

图1 不同细菌物种在接触PmH2A-AMP后的形态变化

三、[KLLK]3阳离子重复基序提升膜裂解效率

TEM结果表明，PmH2A-AMP (5-13)[KLLK]3可对副溶血性弧菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌造成显著形态学损伤，且对革兰氏阴性菌和阳性菌的损伤特征存在明显差异；该肽具备广谱的膜裂解能力，[KLLK]3重复基序的引入显著提升了其对细菌膜结构的破坏效率，也是该肽抗菌活性远高于原始肽的重要原因。

图2 不同细菌物种在接触PmH2A-AMP(5–13)[KLLK]3后的形态变化

四、PAMPs刺激下PmH2A在血细胞与鳃组织的mRNA表达特征

qRT-PCR 检测结果表明，PAMPs 刺激下马氏珠贝PmH2A的mRNA表达在血细胞和鳃组织中呈现明显的时空特异性，且不同PAMPs的诱导效果存在差异，其中LPS的诱导作用最为显著；血细胞是PmH2A响应病原入侵的早期免疫位点，鳃组织则为其发挥抗菌作用的主要效应器官，PmH2A主要参与细菌感染的免疫应答，且在血细胞和鳃组织中均存在二次免疫响应的表达特征。

图3 马丁氏鞭毛虫血细胞及鳃部中对病原体相关分子模式的PmH2A调控作用

五、LPS刺激下鳃组织PmH2A-AMP蛋白的时空表达特征

免疫组化结果表明，LPS 刺激后马氏珠贝鳃组织中 PmH2A-AMP 的蛋白表达呈现明显的时间依赖性。该结果从蛋白水平验证了 PmH2A 的时空表达规律，与qRT-PCR的mRNA 表达结果相互印证，证实鳃组织是PmH2A抗菌肽发挥作用的主要效应器官，其蛋白表达调控主要发生在转录水平，且在鳃丝上皮细胞的特异性高表达体现了免疫防御的空间特异性，同时也为马氏珠贝存在组蛋白介导的类 NETs 先天免疫策略提供了蛋白水平的证据。

图4 脂多糖刺激后鳃组织中 PmH2A-AMP 的分布情况

本研究首次鉴定马氏珠母贝PmH2A基因并合成三类基因衍生抗菌活性肽，确定PmH2A‑AMP (5‑13)[KLLK]3为高效广谱抗菌肽并通过膜裂解途径实现杀菌作用。PAMPs能够诱导PmH2A在血细胞和鳃组织中时序性表达并形成快速响应、循环转运、局部防御的免疫调控通路。该成果系统解析马氏珠母贝先天免疫的分子机理，为新型抗菌制剂研发提供天然先导模板。

本研究采用的三种肽—PmH2A-AMP、PmH2A-AMP（5–21）和PmH2A-AMP（5–13）[KLLK]3是由天津卡梅德生物（KMD Bioscience）使用芴基甲氧基羰基 （Fmoc） 固相化学合成的。合成后，通过反相高效液相色谱（RP-HPLC） 纯化获得目标肽，以备后续用于肽库筛选及相关活性研究。

卡梅德生物（KMD Bioscience）拥有先进的噬菌体展示肽库构建与筛选平台，能够构建容量高达10^13 pfu/mL的超高通量文库。依托该平台，不仅能够提供多种预制肽库（如线性7肽、12肽、15肽及环7肽库），还可根据客户特定目标提供定制肽库构建服务，涵盖文库构建、高通量筛选到测序验证的全流程服务，为您的科研保驾护航。

[1] Shen C, Guo Z, Liang H, Zhang M. Preliminary investigation of the immune activity of PmH2A-derived antimicrobial peptides from the pearl oyster Pinctada fucata martensii. Fish Shellfish Immunol. 2023;135:108691.