一、背景介绍

 噬菌体展示技术（Phage Display Technology）的技术核心可以理解为将外源多肽或蛋白质基因与噬菌体外壳蛋白基因融合，随着传代，外源蛋白会展示在噬菌体颗粒表面，形成噬菌体文库（鱼塘）。同时其编码DNA包裹在颗粒内部，建立“表型”与“基因型”的物理连接。再通过特定靶点（特定鱼饵）对噬菌体文库的筛选，得到与该靶点具有高度亲和力的序列（咬饵的鱼）。

图1 噬菌体展示技术

 噬菌体展示技术在免疫学、药物开发等领域有巨大应用潜力。本文将以最常用的丝状噬菌体M13为例介绍标准的噬菌体展示技术实验方案，包括文库构建、亲和淘选、噬菌体扩增与纯化、阳性克隆筛选与鉴定等关键步骤。

二、文库构建

1.载体准备

对载体质粒进行酶切处理，使其线性化并切除小片段。

2.插入片段制备

 将目的基因片段进行PCR扩增，与限制酶消化。

3.连接

 将纯化的线性化载体与插入片段按优化比例混合，加入连接酶进行连接反应。

4.转化

在高感受态F’宿主菌中电转化连接产物。

5.初级文库扩增与保存

涂布在含Amp的平板上过夜培养，刮取所有菌落重悬于含甘油的培养基中，-80°C保存（细菌文库形式）。

三、亲和淘选

从噬菌体文库中富集特异性结合的噬菌体克隆后，以固相淘选（Biopanning）为例进行亲和淘选：

1.基本流程

（1）噬菌体文库制备：加入辅助噬菌体对保存的细菌文库进行超感染，过夜培养形成初级噬菌体文库。测定噬菌体的滴度（pfu/mL）。

（2）包被：将靶分子包被在合适的固相载体上（如免疫管、酶标板孔、磁珠）。

（3）封闭：用BSA或脱脂奶粉封闭固相的剩余位点，抑制非特异性吸附。

（4）结合：将纯化的噬菌体文库加入包被好的管/孔/磁珠中，孵育一定时间，允许特异性结合。

（5）洗涤：用缓冲液多次冲洗，清除游离及非特异性结合的噬菌体。

（6）洗脱：从固相中洗脱特异性结合的噬菌体。

（7）中和：对酸性/碱性洗脱液进行中和。

图2 亲和淘选

2.淘选轮次

通常选择进行3到5轮的淘选。将洗脱的噬菌体感染新鲜的F'宿主菌，加入辅助噬菌体扩增后进行纯化，作为下一轮的输入文库。记录每轮的输入和洗脱滴度，富集倍数（洗脱滴度/输入滴度）的显著增加是淘选成功的标志。

四、阳性克隆筛选与鉴定

1.单克隆噬菌体制备

 将淘选后的噬菌体感染宿主菌，在含Amp的平板上过夜培养获得单菌落。

2.初步筛选

（1）ELISA： 挑取单个菌落（如96个），经Amp培养后加辅助噬菌体，制备单克隆噬菌体上清。分别与包被靶抗原和对照蛋白（如BSA）孔孵育，洗涤后依次加抗M13抗体、酶标二抗及底物显色。阳性标准为抗原孔相比于对照孔的OD值显著增加。

（2）单点印迹/菌落PCR：可作为快速初筛的替代方法。

3.阳性克隆鉴定

对阳性克隆，纯化其展示的蛋白或表达可溶性蛋白，进行亲和力测定（如表面等离子共振SPR、生物膜干涉BLI、ELISA滴定）。

五、总结与展望

噬菌体展示技术是一个强大而灵活的筛选工具，其高度依赖于精心设计并严格执行的实验操作，需要注意以下几点：（1）在实验过程中严格进行无菌操作，防止噬菌体和细菌的污染。（2）不断监测噬菌体文库的多样性和滴度指标，确保文库的质量。（3）不断优化包被、封闭和洗涤条件，降低噬菌体的非特异性结合。（4）全程保障靶分子的在包被和结合过程中的天然构象和活性。

卡梅德科技（KMD Bioscience）拥有先进的噬菌体展示技术平台，可以提供高质量的定制化噬菌体展示文库构建服务，帮助客户准确、快速的获取对特定靶点高度亲和、高特异性的抗体或配体。

参考文献

[1] Mujahed I M, Ahmed M. Developing recombinant antibodies by phage display technology to neutralize viral infectious diseases[J]. SLAS Discovery, Volume 29, Issue 3, 2024, 100140.

[2] Oscar M G, Marta B, Morten K D S, et al. Deep mining of antibody phage-display selections using Oxford Nanopore Technologies and Dual Unique Molecular Identifiers[J]. New Biotechnology, Volume 80, 2024, 56-68.

[3] Stacey E C, Pablo G, Anna A, et al. Identification of unique binding mode anti-NTF3 antibodies from a novel long VH CDR3 phage display library[J]. SLAS Discovery, Volume 31, 2025, 100216.