Q1：多肽文库的类型？

A1：根据来源可以分为化学合成文库及生物展示文库；根据多肽结构可以分为线性文库和环状文库。

Q2：构建一个随机文库时，如何设计随机区域？

A2：长度：通常选择7-15个氨基酸。太短多样性不足，太长则可能因合成错误导致文库质量下降。

简并密码子：最常用的是 NNK 或 NNG。N (A/T/C/G)代表任意碱基，K (G/T)覆盖所有氨基酸，同时将终止密码子减少到仅1个（TAG）。

使用NNK/NNG能在保证覆盖所有20种氨基酸的同时，最大限度地减少终止密码子的出现。

Q3：如何评估一个多肽文库的质量？

A3：（1）库容量：文库中独立克隆的总数。库容量越大，覆盖的序列空间越广，找到高亲和力配体的机会越大。

（2）多样性：通过随机挑取少量克隆进行测序来评估。序列应分布均匀，无明显偏好性。一个高质量的文库应兼具大库容量和高多样性。

Q4：如何降低筛选过程中的非特异性结合（假阳性）？

A4：（1）使用封闭剂：在筛选前用BSA、脱脂牛奶等封闭剂封闭靶标和容器表面的非特异性位点。

（2）增加洗涤强度：在洗脱步骤前，通过增加洗涤次数或加入温和的去垢剂（如Tween-20）来洗去非特异性结合的噬菌体。

（3）进行“负筛选”：先将文库与不含靶标的基质（如未包被的珠子或孔板）孵育，吸除结合的噬菌体，再将未结合的文库用于正式筛选。这能有效去除与基质本身结合的克隆。

Q5：为什么有时筛选不到高亲和力的多肽？

A5：可能原因包括：

（1）靶标问题：靶蛋白活性丧失、构象不正确或固定化方式掩盖了结合表位。

（2）文库多样性不足：库容量太小，未能覆盖到潜在的结合序列。

（3）筛选条件过于严苛：洗脱条件太强，把所有结合的克隆都洗掉了。

（4）靶点本身“不可成药”：某些靶点的表面可能缺乏适合小分子或多肽结合的“口袋”。

Q6：针对难治性靶点（如GPCR、离子通道），有什么筛选策略？

A6：（1）使用天然片段文库：构建来源于天然蛋白序列的文库，可能更易找到与复杂膜蛋白相互作用的肽段。

（2）全细胞筛选：不纯化靶蛋白，直接在表达目标靶点的活细胞表面进行筛选。这能确保靶点处于天然构象和膜环境。

（3）竞争性筛选：在筛选中加入已知的配体或抗体，以竞争性地筛选出结合在新表位上的多肽。