一．单链抗体的背景

抗体是由B淋巴细胞产生的，能够参与体液免疫的免疫球蛋白，它由2条重链和2条轻链构成可变区及恒定区，抗体通过其可变片段去识别靶抗原。单链抗体（scFv）是人为改造后的抗体，1980年代，BIrd等人设计了scFv作为VL和VH的遗传融合体，它通过短柔性肽去链接VL和VH。scFv是具有抗体活性的最小结合单元，由于其缺少Fc结构域，因此它的体积很小，约为25 kDa，与全长抗体相比，它更容易穿透组织屏障，也更容易渗透在肿瘤组织中，能够应用于靶向癌症治疗药物方面，同时，在检测试剂中也发挥着重要作用。此外，基于scFv不含Fc片段的特点，其免疫原性较低，在人体内引起免疫反应的风险也比较小。scFv还可以在多种表达系统中进行高效表达，包括但不限于大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞表达系统，可根据不同需要进行选择。

图1.常规抗体及scFv抗体结构图

二．单链抗体文库的制备

单链抗体文库的制备基于噬菌体展示技术，将scFv抗体序列插入到噬菌体载体中，进而展示在噬菌体表面。为了获得靶标的单链抗体文库序列，首先我么们需要将靶标作为免疫原进行动物免疫，免疫达到所需效价后采集全血并分离其中的淋巴细胞（PBMC）提取细胞中的RNA，逆转录成cDNA，经PCR扩增得到VH及VL序列，将两者用Linker进行连接并克隆到噬菌体载体中得到重组质粒，将重组质粒转染到大肠杆菌进行噬菌体包装得到噬菌体抗体文库，用于后续文库的筛选。

图2.单链抗体文库制备流程

1. 免疫原的制备：我们需要制备出免疫原性好的靶标分子作为免疫原，免疫原的质量是得到优质抗体的关键。

2. 动物免疫：选择身体状态良好，免疫背景清楚的免疫动物进行免疫，免疫前需采取血清作为阴性对照，免疫方式为背部分散多点免疫，每两周进行一次。

3. PBMC分离：将免疫后的羊驼血清进行效价检测，检测合格后会抽取120ml的羊驼全血，用淋巴细胞分离液进行PBMC的分离。

4. RNA提取及cDNA文库制备：用无酶RNA提取试剂盒提取PBMC中的RNA，反转录成cDNA,再经PCR扩增得到VH及VL序列。

5. 噬菌体文库构建：单链抗体文库构建基于噬菌体展示技术（尤其是M13噬菌体展示技术），通过同源重组的方式将扩增的VH片段与VL片段通过Linker相连并克隆到噬菌体载体上，使得scFv抗体展示在噬菌体表面。免疫文库库容高达10⁹-10¹⁰，文库多样性>90%、插入率95%、阳性率>95%。

6. 噬菌体文库筛选：文库筛选的方式有很多，包括固相、液相、磁珠及细胞筛选，先进行负向筛选再进行正向筛选为一轮，通常3-4轮就可以得到亲和力强且针对靶标分子的抗体序列。

7. scFv抗体表达：根据下游实验的需要可以对抗体进行个性化定制，比如各种种属来源的IgG表达、各种种属的scFv抗体表达等。

        卡梅德生物可为客户提供各种种属的scFv抗体文库构建服务，比如驼源、鼠源、兔源、牛源、猪源等，根据客户的需求进行合理的方案设计和个性化定制，为客户的科研项目及药物抗体开发助力。

引用：

[1] Ahmad ZA, Yeap SK, Ali AM, Ho WY, Alitheen NB, Hamid M. scFv antibody: principles and clinical application. Clin Dev Immunol. 2012;2012:980250.

[2] Ma H, O'Kennedy R. The Structure of Natural and Recombinant Antibodies. Methods Mol Biol. 2015;1348:7-11.  

[3] Shim H. Antibody Phage Display. Adv Exp Med Biol. 2017;1053:21-34.