Q1. 如何根据靶蛋白特性设计WB实验的核心参数？

A1:(1) 凝胶浓度设计：需依据靶蛋白分子量调整，小分子蛋白选择较高浓度凝胶以提升分离精度，大分子蛋白则采用低浓度凝胶避免迁移受阻。

(2) 转膜参数匹配：中低分子量蛋白可选用半干式转膜法，兼顾效率与便捷性；高分子量蛋白需优先采用湿式转膜法，搭配预冷缓冲液并适当延长转膜时间。

(3) 抗体孵育条件：疏水结构丰富的靶蛋白可适当提高孵育温度或延长孵育时间，亲水性靶蛋白则需控制孵育条件避免抗体非特异性结合。

Q2. WB实验中不同类型固相膜的选择依据及使用注意事项有哪些？

A2:固相膜的选择需结合靶蛋白分子量与实验需求，NC膜对小分子蛋白结合力较强，且成本较低，适合常规蛋白检测；PVDF膜化学稳定性更佳，蛋白结合容量更高，尤其适用于低丰度靶蛋白检测及后续蛋白测序等延伸实验。

使用时需注意，PVDF膜在使用前需用甲醇预处理以激活膜上活性基团，而NC膜无需此步骤。两种膜均需避免反复冻融，储存时需密封置于干燥环境，防止膜结构破坏影响蛋白结合效率。此外，膜的孔径也需匹配靶蛋白分子量，大孔径膜适合大分子蛋白穿透结合，小孔径膜则能提升小分子蛋白的结合稳定性。

Q3. 如何避免WB实验中样本交叉污染及影响实验重复性的关键因素？

A3: (1) 样本处理环节：使用一次性耗材处理不同样本，实验器械需经高温灭菌或蛋白抑制剂处理，避免样本间蛋白残留污染；样本裂解后及时离心分离，避免细胞碎片干扰。

(2) 试剂配制与使用：核心试剂如抗体、裂解液需分装保存，避免反复冻融导致活性下降；缓冲液需新鲜配制，标注配制日期，严禁不同批次或不同类型缓冲液混合使用。

(3) 操作流程规范：严格遵循实验时序，避免样本长时间暴露于室温；孵育、洗涤等关键步骤的时间和温度需精准控制，确保不同实验组操作条件一致。

Q4. 针对低丰度靶蛋白的WB实验优化策略有哪些？

A4: (1) 样本富集处理：可通过免疫沉淀、超速离心等方法对低丰度靶蛋白进行富集，提升样本中靶蛋白浓度；也可增加样本上样量，但需注意避免因上样量过大导致凝胶过载。

(2) 抗体体系优化：选用高亲和力、高特异性的单克隆抗体，通过棋盘滴定法确定最优抗体浓度；采用信号放大系统，如生物素-亲和素放大系统，提升检测信号强度。

(3) 检测系统升级：选用高灵敏度化学发光底物，确保底物新鲜配制并均匀覆盖膜表面；采用冷CCD成像系统替代传统暗室曝光，提升信号检测的灵敏度和准确性。

(4) 实验对照设置：增设空白对照和阴性对照，排除非特异性信号干扰；设置梯度浓度的标准品，建立定量标准曲线，提升低丰度蛋白定量的可靠性。

Q5. 如何通过对照设置排除WB实验中的非特异性干扰？

A5:（1）阳性对照设置：选用已知高表达靶蛋白的细胞或组织样本作为阳性对照，验证实验体系的有效性，同时可作为定量分析的参考标准。

（2）阴性对照设置：采用不表达靶蛋白的细胞或组织样本，或通过基因敲除技术构建的阴性样本，排除样本中内源性蛋白的交叉反应干扰。

（3）空白对照设置：在实验中设置仅加入缓冲液和试剂、不加入样本的空白对照，排查试剂污染或非特异性结合导致的假阳性信号。

（4）二抗对照设置：单独进行二抗孵育实验，不加入一抗，直接判断背景信号是否来源于二抗的非特异性结合，为后续实验优化提供依据。