Q1：什么是scFv抗体？

A1：scFv抗体，中文全称是单链可变区片段，它是一种通过基因工程改造得到的小分子抗体。scFv由一个抗体的重链可变区和一个轻链可变区通过一条人工设计的短肽连接链连接而成。可变区是抗体的“指纹识别”区域，决定了抗体能特异性地结合哪种抗原；连接肽是一条柔性的氨基酸短链（最常用的是(GGGGS)₃），它的作用就像一根绳子，把VH和VL拴在一起，帮助它们形成正确的三维结构，从而行使功能。

Q2：针对多次跨膜蛋白其筛选的技术难点在哪里？

A2：多次跨膜蛋白因其复杂的跨膜结构在蛋白制备方面比较难，尽管能少量制备其结构也非常不稳定并且其纯度也没有办法保证。所以在筛选源这方面需要考虑其他类型的抗原，比如构建过表达细胞系进行细胞筛选，或者制备过表达靶标的腺病毒及腺相关病毒等通过固相筛选的方式进行，因为这些方式可以尽可能地保留靶标的天然结构，使被筛选出的抗体可以结合天然结构。

Q3：筛选出的抗体序列怎么验证其与靶标抗原的结合情况呢？

A3：首先在抗体角度可以用单克隆诱导后的粗提物进行验证或者将阳性克隆序列进行重组表达，然后用重组抗体进行验证。验证结合的方法有很多种，最简单的方法就是ELISA，将抗原包被在ELISA板子上，将抗体与之结合，检测其OD值的变化，结合情况越好OD值越高；流式细胞术的方式也是比较容易实现的，是从细胞水平检测结合情况，只不过这种方式适合于有天然表达或过表达靶标的细胞的情况下采用，好处就是靶标更接近天然构象，验证后的抗体在后续动物实验过程中更有保障；SPR是目前为止验证亲和力的金标准，是可以准确验证出抗原抗体的亲和力常数；BLI的原理与SPR不同，可单浓度验证（预算不充足），也可多浓度验证；MST对样本纯度、分子量的要求比较低，但是灵敏度也差于SPR和BLI；ITC可以直接、全面获取热力学参数的方法，且全程在溶液中进行，无需固定或标记样品，但是样品所需量会比较高。

Q4：为什么针对复杂抗原的scFv筛选更具挑战性？

A4：（1）靶标丰度低：目标抗原在复杂的背景（如整个细胞表面）中可能只占极少部分。

（2）抗原构象：很难保证筛选过程中抗原始终保持其天然、功能性构象（特别是对于膜蛋白）。

（3）高背景：非特异性结合克隆会大量出现，掩盖真正的阳性信号。

（4）表位复杂性：容易筛选到针对免疫优势但非功能性表位的抗体。

Q5：从库中筛选到大量阳性克隆后，如何确定先对哪些进行深入研究？

A5：应对阳性单克隆进行初步表征，确定优先级：

（1）特异性验证：通过FACS、免疫荧光等确认其能结合天然状态下的目标细胞，而不结合阴性对照细胞。

（2）亲和力初步评估：使用ELISA竞争实验或表面等离子共振等生物传感器进行粗略排名。

（3）序列分析：对scFv的VH和VL序列进行测序，将克隆归为不同的家族（具有独特CDR3序列的视为一个独特克隆）。优先选择不同序列家族的克隆，以增加获得不同表位抗体的机会。

（4）功能实验：如果可能，进行初步的功能实验（如阻断、内化等），看是否具有所需的功能特性。