图1 MST技术原理

MST技术的核心原理在于利用红外激光在样品毛细管中创造一个精确的局部温度梯度场。

通常先将一种目标分子（如蛋白质）用荧光染料进行标记，当红外激光照射样品时，会形成一个温度分布不均的区域，分子会因自身特性（如大小、电荷、水合层）沿着温度梯度发生定向泳动。若该标记分子与未标记的配体分子发生结合，其表面特性会发生改变，从而导致其在温度场中的泳动速度发生变化。

分子标记的方式有两种：荧光染料或荧光蛋白（如NT.115系统），或是利用色氨酸的内源荧光实现无标记检测（NT.LabelFree系统）。通过滴定不同浓度的配体并分析荧光分布平衡态的变化，可以拟合获得结合常数（KD值），灵敏度可以达到pM级别，从而准确表征分子间互作亲和力与动力学参数。

图2 MST技术验证谷氨酸与ASIC1a 蛋白的结合

MST 亲和力测定结果的关键在于对所生成的结合曲线及拟合模型进行分析。其中X轴代表滴定体系里未标记配体分子（Ligand）浓度所对应的对数值，Y轴则对应经过归一化处理的荧光数值，或是微量热泳动的变化数值。

一条成功的结合曲线会呈现清晰的“S”形曲线特征：

1. 在低浓度配体区，曲线较为平坦，表明几乎没有结合发生

2. 随着配体浓度增加，曲线出现陡峭的上升或下降，标志着复合物形成的过渡阶段

3. 在高浓度区，曲线再次变得平坦，表明所有目标分子都已饱和，结合达到平台期。

软件会通过非线性拟合将这条实验数据曲线与理论结合模型（最常用的是1:1结合模型）进行拟合，从而计算出关键参数。

最重要的解读参数是平衡解离常数（KD值），它直接反映了相互作用的两种分子之间亲和力的强弱。KD值越小，表明两种分子的结合越紧密、亲和力越高。如果曲线异常或拟合度差，提示可能存在着非特异性结合、分子聚集或是多为点结合等更复杂的结合模式，需要进一步优化实验或分析。

1. 极高灵敏度：仅需皮摩尔级样品量。

2. 广泛适用性：接近天然溶液环境进行测量。

3. 无需固定化：免去了包被或锚定的繁琐步骤。

4. 检测范围宽广：可测解离常数从pM至mM级别。

5. 样品消耗极低：通常只需微量（μL）样本。

6. 直接测量结合：实时监测分子互作动态过程。

7. 抗干扰能力强：适用于复杂样品如细胞裂解液。

--专业的技术团队和丰富的技术经验

--检测效率高，无需标记、实时监测

--先进的仪器设备

--应用范围广泛：可用于蛋白、核酸、多肽、纳米材料等分子互作分析

--提供真正的一站式服务：提供从亲和力测定服务，到分子互作研究的一体化解决方案