一、 细胞培养的基本原理与实验室基础建设

细胞培养的核心在于于体外模拟机体内环境，为细胞提供存活、增殖及行使功能所必需的条件。这些条件主要包括适宜的温度、适宜的气体环境、稳定的酸碱度以及营养全面的培养基。

1. 实验室规划与核心设备

一个功能完备的细胞实验室应严格区分为试剂准备区、缓冲区和无菌操作区。无菌操作在超净工作台或生物安全柜中进行，其形成的单向、垂直流动的无菌空气屏障，是整个细胞培养流程中防止微生物污染的第一道也是最重要的一道防线。

此外，细胞房必须配备能精确控制二氧化碳浓度和温度的培养箱、用于日常观察的倒置显微镜、进行细胞收集的离心机以及用于试剂预热的水浴锅等关键设备。

2. 试剂与无菌耗材管理

培养基是细胞的“营养来源”，通常包含基础营养物质、血清或无血清添加剂。所有液体，如培养基、胰酶、PBS等，在使用前必须确认其无菌性。

培养瓶、培养皿、移液管等均为一次性无菌耗材，其规范使用是落实无菌操作理念的物质基础。在筹划任何具体的细胞培养方法之前，完备且规范的实验室基础建设是确保后续所有步骤成功的先决条件。

二、 核心细胞培养方法的技术剖析

1. 原代培养

这种方法直接从机体组织分离细胞并进行初次培养。原代细胞最能体现其在体内的生物学特性，但这种方式制备流程繁琐、细胞异质性高、体外增殖能力也有限。这项技术的关键是用酶消化或机械分离法，在不严重损伤细胞的前提下，把组织分解成单个细胞悬液。

2. 传代培养

当贴壁细胞生长融合度达到80%至90%，或悬浮细胞密度过高时，必须进行传代。这是常规细胞培养流程中的核心环节，目的是将细胞以特定比例稀释并接种至新的器皿，为其提供持续的生存空间与营养。该细胞培养方法的关键在于使用胰蛋白酶等精确消化细胞与培养表面及细胞之间的连接，并通过离心去除消化液及细胞碎片。

3. 细胞冻存与复苏

为长期保种细胞、维持遗传稳定性并减少连续培养带来的变异，细胞冻存是一项至关重要的细胞培养方法。标准流程是使用程序性降温盒，将细胞与含冷冻保护剂的培养基缓慢冷冻后，转移至液氮中长期保存。

复苏时则要求快速解冻，并立即用新鲜培养基稀释以去除冷冻保护剂，离心后重悬并接种。严谨的冻存与复苏操作是保证整个细胞培养流程可重复、可持续的核心环节之一。

图1 细胞培养

三、 无菌操作规范的精细化执行

1. 操作前精细化准备

实验人员需身着干净实验服、佩戴口罩及无菌手套，所有放入超净工作台的物品包括试剂瓶、移液器、手套等都要经75%乙醇喷洒并擦拭，超净工作台内部空间需合理规划且物品放置不可过满以保证无菌空气流场不被干扰，实验操作前打开紫外线灯对台内空间照射时间至少30分钟。

2. 操作中规范化手法

◆ 火焰消毒：对于可耐受的玻璃或金属器皿，在开启和关闭瓶口前，应使其口部快速通过酒精灯火焰外焰，以达到瞬时高温灭菌的效果。

◆ 规避污染路径：手臂及未灭菌物品严禁跨越已开放的培养器皿或试剂瓶口正上方。开启后的瓶盖应内面朝上，稳妥置于无菌台面上。

◆ 精准液体操作：使用经过校准的电动移液器配合无菌吸头，动作需轻柔平稳，避免产生气泡或导致液体飞溅。任何接触过非无菌表面的吸头必须立即更换，不得重复使用。

3. 试剂与耗材的专一管理：严格执行“专细胞系专用”原则，不同细胞株所使用的培养基、胰酶等试剂应明确区分，并做好标记，严防交叉污染。取用后须立即盖紧瓶盖，已开封试剂应避免在超净台外长时间暴露。卓越的无菌操作技能是所有高级细胞培养方法得以成功实施的基石。

四、 常规细胞培养流程的详细分解

1. 实验前准备：提前开启超净工作台和室内空调系统，营造稳定环境。将所需培养基、胰酶、PBS等试剂从冰箱取出，置于37℃水浴锅中充分预热。复核二氧化碳培养箱的温度、湿度及气体浓度设置是否准确。

2. 日常观察与状态评估：在操作细胞前，首先使用倒置显微镜进行系统观察。评估指标包括：细胞形态是否饱满、轮廓是否清晰、贴壁是否牢固、培养液颜色以及有无可疑的污染迹象如浑浊、漂浮物等。

3. 换液操作：对于生长缓慢或需要维持的细胞，需定期换液。吸除旧培养液时，移液器吸头应伸入液面下方但避免触及细胞层，缓慢吸尽。然后沿培养器皿侧壁缓慢加入预温的新鲜培养液，避免直接冲刷细胞层。

4. 传代培养的步骤：

(1) 去除旧液：吸尽旧培养液。

(2) 清洗：加入预温的PBS轻轻润洗细胞表面，然后吸尽，以去除残余血清干扰胰酶活性。

(3) 消化：加入适量预温的胰酶，确保其覆盖整个细胞层。移至培养箱中静置消化。消化时间需通过显微镜密切监控，待细胞间隙增大、形态变圆但尚未大量漂浮时即为最佳终点。

(4) 终止消化：加入含血清的完全培养基，其体积至少是胰酶体积的两倍，通过吹打操作终止胰酶作用。

(5) 离心收集：将细胞悬液转移至离心管，以特定转速离心数分钟，使细胞沉淀。

(6) 重悬与计数：弃去上清液，加入定量的新鲜培养液，轻柔吹打形成单细胞悬液。取少量进行细胞计数。

(7) 分瓶接种：根据计数结果，计算出所需细胞悬液体积，接种至含有新鲜培养基的新培养器皿中，通过十字晃动摇匀。

(8) 记录与终末处理：详细记录此次操作的日期、细胞状态、传代比例、细胞计数结果、使用的试剂批号等关键信息。所有生物废弃物料需统一收集并进行无害化处理。最后用75%乙醇彻底擦拭超净工作台内部，保持其清洁待用状态。

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参考文献

[1] Philippeos C, Hughes RD, Dhawan A, Mitry RR. Introduction to cell culture. Methods Mol Biol. 2012;806:1-13.

[2] Lucey BP, Nelson-Rees WA, Hutchins GM. Henrietta Lacks, HeLa cells, and cell culture contamination. Arch Pathol Lab Med. 2009 Sep;133(9):1463-7.

[3] Bykowski T, Stevenson B. Aseptic Technique. Curr Protoc Microbiol. 2020 Feb;56(1):e98.

[4] Lian J, Ma X, Li X, Xia L. The environmental microbial retrieving assessment of cell-processing facilities for cell therapy in a hospital laboratory. Microbiol Spectr. 2024 Oct 3;12(10):e0125724.

常见问题解答

Q1：选择细胞培养用血清时，除了无菌性还需关注什么？

A1：（1）批次一致性：不同批次血清成分差异大，易导致细胞状态波动，需小批量试用后固定适配批次，更换时需先做适应性培养。

（2）细胞适配性：干细胞需胎牛血清（含多能性维持因子），部分肿瘤细胞可用小牛血清，需按细胞说明书选择。

（3）关键质量指标：内毒素≤5 EU/mL（避免细胞炎症）、血红蛋白≤10 mg/dL（防培养基浑浊），且需确认支原体阴性。

（4）储存要求：避免反复冻融，4℃存1-2 周，长期-80℃冷冻，解冻时37℃水浴缓慢融化并轻轻混匀。

Q2：细胞轻微污染后，用过的培养器皿该怎么处理？

A2：（1）预处理：先将污染培养液倒入含消毒剂的生物废液桶，再用 PBS 冲洗器皿 2-3 次，减少灭菌负担。

（2）分类灭菌：玻璃 / 金属器皿 121℃、103kPa 高压灭菌 20-30 分钟；一次性耗材用 75% 乙醇浸泡 30 分钟后，装入医疗废弃物袋统一处理。

（3）环境清洁：用 1:100 稀释的含氯消毒剂擦拭超净台、培养箱，静置 30 分钟后用 75% 乙醇二次擦拭，再开紫外线灯照射60分钟，防止污染扩散。

Q3：细胞计数时团块多影响结果，有什么解决办法？

A3：（1）悬液预处理：加少量胰酶（悬液体积 1/10）室温放置 1-2 分钟解离细胞，再加培养基终止；杂质团块用 40-70μm 细胞筛过滤，并用培养基冲洗筛网。

（2）优化吹打：用 1mL 移液器贴近管壁缓慢吹吸 5-8 次，避免用力过猛产生气泡，吹打后静置 1-2 分钟，取上层均匀悬液计数。

（3）计数板技巧：提前消毒计数板，滴液时避免溢出，观察到 2-3 个细胞的小团块按单个计，5 个以上大团块排除，同时记录团块数量评估分散度。

（4）后续调整：若反复出现团块，可延长传代消化时间或加 0.02% EDTA 增强分散性，需提前测试 EDTA 对细胞活力的影响。

Q4：细胞复苏后活力低，可能是哪步错了？

A4：（1）解冻不当：未在 37℃水浴 1-2 分钟快速解冻，细胞内形成冰晶破坏结构，需立即融化并擦净冻存管外壁。

（2）冷冻保护剂处理不及时：复苏后未立即加 5-10 倍预温培养基稀释 DMSO，或未离心弃上清，DMSO 毒性损伤细胞。

（3）冻存问题：未用程序性降温盒（降温过快）、DMSO 浓度不当（5%-20%外），或冻存细胞状态差（融合度超 90%、微污染）。

（4）培养条件偏差：培养箱温湿度异常（＜36℃/＞38℃、湿度＜95%），或用未预热培养基，细胞适应困难。

Q5：无菌手套碰了非无菌台面该怎么办？

A5：（1）立即换手套：停止操作，脱污染手套（避碰内侧），放入医疗废弃物袋，新手套按规范佩戴，确保贴合无褶皱。

（2）处理污染材料：若已接触无菌耗材/培养基，耗材需乙醇浸泡后处置，培养基倒入废液桶，不可使用。

（3）清洁操作区：用75%乙醇擦超净台及台内耗材，非无菌台面用 1:100 含氯消毒剂擦净，静置30分钟后清水擦。

（4）预防措施：戴手套前确保手干，台内只放无菌物品，取台外物品需先脱手套，减少污染概率。