在蛋白质相互作用研究、抗体筛选及功能基因发掘领域，酵母文库是核心工具之一，其工作原理是将外源基因片段与酵母表达载体连接后把连接产物转化到酵母细胞内，最终形成含有大量克隆的集合体并为后续各项研究提供充足分子模板。

酵母表面展示技术与酵母筛选技术是酵母文库的配套技术，前者能将文库里的目的蛋白锚定在酵母细胞膜表面，后者可从海量克隆中精准筛选出目标阳性克隆，这三项技术共同组成高效的分子筛选体系。

SMART（Switching Mechanism at 5' End of RNA Transcript）技术是目前构建高质量酵母文库的主流方法，依托自身高效获取全长 cDNA的优势，它既大幅提升了酵母文库的实用价值，也为酵母表面展示技术中蛋白的活性及酵母筛选技术的准确性提供关键支持。

SMART技术的原理与优势

SMART 技术最初为高效制备全长cDNA研发，核心是利用逆转录酶的模板转换特性。真核生物mRNA的5’端通常带有帽子结构，SMART技术通过设计特制的逆转录引物和模板转换寡核苷酸（TS Oligo）在逆转录过程中完成mRNA全长cDNA的捕捉。逆转录酶完成第一条链合成后会在 cDNA的3’端增添若干不依赖模板的C碱基，这些碱基与TS Oligo的G碱基配对后带动酶“转换”到TS Oligo 上继续合成，最终生成含有完整5’端信息的双链cDNA。

将该技术用于酵母文库构建时可把目的基因（如 scFv、纳米抗体等）的cDNA与酵母表面展示载体融合，这类载体通常含有酵母启动子、表面锚定蛋白（如 Aga2p）及同源重组臂。借助 SMART 技术获得的 cDNA 片段与线性化载体共同转化酵母细胞，利用酵母自身的高效同源重组系统实现目的基因与载体的无缝连接，最终构建出高多样性的酵母表面展示文库。

图1  SMART技术流程

酵母表面展示文库的构建流程

典型的SMART技术介导的酵母文库构建包含以下步骤：

1. RNA提取与质量控管：从目标细胞（如免疫后的B细胞）中提取高质量mRNA，确保RNA完整性。

2. SMART逆转录：使用含Oligo(dT)的SMART引物和TS Oligo进行逆转录，合成全长cDNA第一链。

3. PCR扩增：通过高保真PCR扩增目的基因片段，同时引入与酵母载体同源的末端序列。

4. 载体线性化：对酵母表面展示载体进行酶切处理，暴露与插入片段同源的臂序列。

5. 共转化与同源重组：将PCR产物与线性化载体按比例混合，通过电转化导入酵母细胞（如EBY100菌株），利用酵母内源重组系统完成载体组装。

6. 文库库容与多样性评估：通过稀释涂板计算转化子数量，并通过测序评估插入片段多样性。

与传统限制性内切酶依赖的克隆方法相比，SMART技术结合同源重组构建的文库具有以下优势：

• 避免酶切效率导致的偏好性

• 保留基因全长信息

• 重组效率高，库容可达10⁷–10⁹

• 适用于高通量筛选场景

酵母筛选策略与应用

构搭建完成的酵母表面展示文库需通过功能性酵母筛选获取目标蛋白，目前最常用的筛选手段是荧光激活细胞分选（FACS）和磁珠激活细胞分选（MACS）。抗原结合筛选中需将文库酵母与标记生物素或荧光素的抗原共同孵育后，利用荧光二抗或链霉亲和素偶联磁珠富集阳性克隆，多轮反复迭代筛选可逐步提升结合亲和力或特异性。

与传统方法相比，酵母筛选的优势在于其真核表达系统可支撑复杂蛋白正确折叠与修饰且能直接通过流式细胞术定量分析结合强度，酵母细胞表面同时展示目的蛋白与标签蛋白（如 c-Myc），便于通过双色荧光信号排除非特异性结合提升筛选准确性。

目前 SMART 技术是构建大型酵母表面展示文库的主流方法之一，尤其适用于抗体库、T 细胞受体库等需要高多样性与全长保真性的场景。SMART 技术通过自身独特的模板切换机制与酵母高效重组系统结合，显著提升酵母文库的构建质量与效率，为基于酵母表面展示的功能性筛选奠定坚实基础。

[1]Bidlingmaier S, Liu B. Construction and application of a yeast surface-displayed human cDNA library to identify post-translational modification-dependent protein-protein interactions. Mol Cell Proteomics. 2006 Mar;5(3):533-40.

[2] Boder ET, Wittrup KD. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol. 1997 Jun;15(6):553-7.

[3] Weinfurter JT, Bennett SN, Reynolds MR. A SMART method for isolating monoclonal antibodies from individual rhesus macaque memory B cells. J Immunol Methods. 2024 Feb;525:113602.

常见问题解答

Q1：采用 SMART 技术构建的酵母文库需长期保存以满足后续实验需求，应选择何种保存条件？需注意哪些关键细节？

长期保存建议采用 - 80℃甘油冷冻保存，具体操作：将文库酵母菌液与无菌甘油按体积比 4:1 混合（终甘油浓度 20%），分装至无菌冻存管（每管 1-2mL），快速放入 - 80℃冰箱（避免梯度降温，防止冰晶损伤酵母细胞）。需注意三点：

1. 分装前需确保酵母处于对数生长期（OD600≈0.8-1.0），此时细胞活力最高，冻存后复苏率可达 80% 以上；

2. 避免反复冻融，每次取用后立即放回- 80℃，若需频繁使用，可分装多管；

3. 每6-12 个月需复苏一次，接种至YPD培养基培养后重新冻存，防止酵母长期保存中发生基因突变或质粒丢失，导致文库多样性下降。

Q2：使用 FACS 筛选酵母文库时，除了文章提及的双色荧光信号，还可通过哪些实验设计进一步区分真阳性克隆与假阳性克隆？

可通过设置多重对照与梯度验证实验区分：

1. 设置 “空载酵母对照”，将未插入目的基因的线性化载体转化酵母，与抗原孵育后进行 FACS 检测，其荧光信号值可作为假阳性的基线阈值，高于该阈值的克隆才进入后续验证；

2. 开展 “竞争结合实验”，在筛选体系中加入过量未标记的可溶性抗原，若克隆的荧光信号显著下降（下降幅度≥50%），说明其结合具有特异性，为真阳性；

3. 进行 “梯度抗原浓度筛选”，用3-5个梯度浓度的抗原孵育克隆，真阳性克隆会随抗原浓度升高呈现明显的荧光信号递增趋势，而假阳性克隆信号无规律或无递增，可进一步排除非特异性结合克隆。

Q3：利用 SMART 技术构建针对复杂蛋白（如多结构域膜蛋白）的酵母表面展示文库时，可能面临哪些特殊挑战？如何应对？

主要面临两大挑战：

1. 膜蛋白的疏水性跨膜结构域易在酵母细胞内聚集，导致表面展示效率低，甚至影响酵母细胞活力；

2. 膜蛋白需依赖特定辅助因子（如胆固醇、糖基化修饰）形成正确构象，酵母的修饰系统可能无法满足，导致展示的蛋白无结合活性。

应对措施：

1. 改造酵母表面展示载体，在膜蛋白基因与锚定蛋白（Aga2p）之间插入柔性连接肽（如（Gly4Ser）3），减少跨膜结构域与锚定蛋白的空间位阻，同时在载体中加入内质网信号肽，引导膜蛋白正确转运至细胞膜；

2. 优化酵母培养环境，在培养基中添加适量胆固醇（如 10μg/mL），或选择能进行复杂糖基化修饰的酵母菌株（如 Pichia pastoris GS115），补充膜蛋白构象形成所需的辅助条件；

3. 降低膜蛋白表达量，通过减弱启动子强度（如将 GAL1 启动子替换为 GAL10 启动子），避免蛋白过量聚集，提升展示效率。

Q4：酵母文库筛选获得阳性克隆后，为确认其功能与预期一致，需开展哪些核心后续验证实验？各实验的核心目的是什么？

需开展四项核心验证实验：

1. “质粒提取与测序验证”，从阳性克隆中提取酵母质粒，进行 Sanger 测序，确认目的基因序列正确无误，无移码突变或碱基缺失，排除因 PCR 扩增或同源重组导致的基因序列异常；

2.  “蛋白表达验证”，通过 Western blot 检测酵母细胞膜蛋白提取物，使用针对锚定蛋白（如 Aga2p）或目的蛋白标签（如 c-Myc）的抗体，确认目的蛋白已成功在酵母表面表达，避免 “假阳性” 源于基因未表达却产生的非特异性信号；

3.  “体外结合活性定量验证”，采用 ELISA 法，将抗原包被于酶标板，加入阳性克隆菌液，通过检测荧光或酶活信号，定量计算结合亲和力（KD 值），确认其结合能力符合实验需求；

4.  “功能验证实验”（依研究目标而定），如抗体克隆需进行中和活性实验（检测对病原体的抑制效果），酶类克隆需进行酶活测定，确保阳性克隆不仅能结合目标分子，还具备预期的生物学功能，为后续应用提供依据。