一．噬菌体展示肽库

噬菌体展示肽库是依赖于噬菌体展示技术将多样的多肽序列展示到噬菌体表面，每个被改造的噬菌体上都会表达插入的多肽序列。首先需要将多肽的核苷酸序列进行双链DNA合成，将多肽基因序列以同源重组的方式插入到噬菌体载体的外壳蛋白序列中，将重组表达载体转化到相应的宿主菌中进行噬菌体的合成及组装，在阅读框正确的情况下目标多肽与外壳蛋白形成重组蛋白展示到噬菌体表面，在靶标的捕获下，经噬菌体展示的一些多肽就会在众多多肽中“脱颖而出”，这一过程即为多肽文库筛选，经过3-4轮的文库筛选就可以获得靶标高亲和力及特异性的多肽，以M13辅助噬菌体为例，如图所示：

图1.噬菌体展示技术筛选原理

二．噬菌体展示技术

目前存在的噬菌体展示技术所用噬菌体有M13、T7、 MS2、T4、fd等，卡梅德生物基于噬菌体展示技术的肽库构建方法主要以M13噬菌体以及T7噬菌体为主，而M13噬菌体又分为野生型M13噬菌体体系以及M13辅助噬菌体体系。

1. 野生型M13噬菌体体系

M13是一种丝状噬菌体，其基因组为单链环状DNA 。其复制依赖于大肠杆菌，通过滚环复制产生双链DNA，再以双链 DNA为模板转录和翻译衣壳蛋白，并合成新的单链基因组。外源基因通常插入到M13基因组的pIII或pVIII的基因序列中，形成融合基因。

•PIII展示：它主要负责识别和结合宿主菌的F菌毛（由F质粒编码），是感染的关键。将外源肽/蛋白融合在pIII的N端（远离细胞膜结合域）是最常用且成熟的策略。由于pIII拷贝数低（3-5个拷贝），这种展示通常是单价或低价的，有利于筛选高亲和力配体，减少因多价结合造成的假阳性。

•pVIII展示：pVIII是构成噬菌体管状衣壳的主要蛋白，拷贝数极高（约2700个拷贝/噬菌体）。将外源基因插入pVIII基因中，会导致多价展示（每个噬菌体展示上千个融合pVIII）。这对于展示小肽、筛选低亲和力相互作用或需要多价效应的情况有利。但大蛋白插入pVIII通常会影响噬菌体的组装和稳定性，因此pVIII展示更适用于小肽。

图2.pIII及pVIII

•蓝白斑筛选原理：在本体系中我们常用的载体为M13 KE载体，与常规载体相比M13 KE载体在复制前端引入了LacZ基因，完整的LacZ基因可以编码有催化活性的β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶可以使得指示底物X-gal被分解，而插入的目的片段的位置会截断LacZ基因，使其不能发挥作用，所以将转化后的宿主菌培养在含有X-gal及相应抗性的平板上时，未被转化的宿主菌不能存活，载体中未插入目标序列的菌株可以编码有活性的β-半乳糖苷酶催化X-gal的分解使背景呈现蓝色，载体中插入目标序列的菌株不可以编码有活性的β-半乳糖苷酶催化X-gal的分解，所以背景为平板颜色，即蓝色为阴性菌落，白色为阳性菌落。

2. M13辅助噬菌体体系

该体系的两个重要元素是噬菌粒 (Phagemid)和辅助噬菌体 (Helper Phage)。

•噬菌粒 (Phagemid)： 它是特殊的质粒载体，缺失自身复制和包装所需元件（如包装信号等）。

•辅助噬菌体 (Helper Phage)： 它是经过基因改造的缺陷型M13噬菌体（如M13KO7, VCSM13），它提供噬菌粒复制和包装所需的蛋白，但其自身的包装信号被弱化或缺失。

•包装原理：将携带外源基因插入的噬菌粒转化进入合适的大肠杆菌宿主（F⁺菌株），用辅助噬菌体超感染 (superinfect) 该宿主菌，辅助噬菌体提供复制和结构蛋白，产生大量野生型衣壳蛋白（pIII, pVIII, pVI, pVII, pIX等），噬菌粒表达融合的衣壳蛋白（如融合pIII）。由于辅助噬菌体的包装信号被弱化/缺失，而噬菌粒包含了完整的包装信号，绝大部分被包装进子代病毒颗粒的基因组是噬菌粒的ssDNA，所以产生的子代颗粒只含有噬菌粒基因不含有辅助噬菌体的基因，在筛选过程中一直依赖辅助噬菌体。

图3.野生型M13及辅助噬菌体型M13噬菌体的包装

3. T7噬菌体体系

T7是一种裂解性、短尾噬菌体，基因组为双链线性DNA 。其感染周期非常快（约1-2小时），感染后迅速关闭宿主基因表达，利用自身的RNA聚合酶高效转录自身基因，使得子代噬菌体在宿主细胞中被大量合成并组装，最终通过裂解释放出来。

•展示原理：

（1）构建重组T7噬菌体基因组：将外源基因插入到gp10基因的特定位置（通常在gp10B的C端），形成融合基因。重组基因组通过in vitro包装或同源重组技术获得。

（2）感染宿主：重组T7噬菌体感染敏感的大肠杆菌宿主（通常为BL21或衍生株），与M13体系相比T7体系可感染的宿主菌局限更小范围更广。

（3）高效表达与组装：T7 RNA聚合酶高效转录包括融合gp10基因在内的晚期基因。融合的gp10蛋白（通常是gp10B融合体）与野生型的gp10A和gp10B蛋白一起被表达。

（4）衣壳组装与展示： 在细胞质内，gp10蛋白组装成T7病毒衣壳（二十面体头部）。融合的gp10B蛋白可以共组装到衣壳结构中，将其融合的外源肽/蛋白展示在衣壳表面。由于噬菌体表面有415个gp10蛋白使得每个T7噬菌体颗粒表面可以展示多达415个拷贝的外源蛋白，但由于融合蛋白通常基于gp10B，实际展示拷贝数受融合蛋白表达水平和组装兼容性的影响，但仍可达到多价展示。

（5）裂解与释放：大量展示有外源蛋白的子代噬菌体颗粒通过裂解宿主细胞得以释放出来。

引用：

[1] Ledsgaard L, Kilstrup M, Karatt-Vellatt A, McCafferty J, Laustsen AH. Basics of Antibody Phage Display Technology. Toxins (Basel). 2018 Jun 9;10(6):236.

[2] Nur A, Schubert M, Lai JY, Hust M, Choong YS, Isa WYHW, Lim TS. Antibody Phage Display. Methods Mol Biol. 2023;2702:3-12.

[3] Piggott AM, Karuso P. Identifying the cellular targets of natural products using T7 phage display. Nat Prod Rep. 2016 May 4;33(5):626-36.