牛单B细胞分选与超长CDR3抗体开发

一、牛单B细胞技术原理

1.B细胞免疫学基础

哺乳动物成熟 B 淋巴细胞遵循一个 B 细胞对应一套天然配对重链（VH）与轻链（VL）基因、仅分泌单一特异性抗体的核心规律。传统杂交瘤技术依靠细胞融合实现 B 细胞永生化，但牛 B 细胞体外融合难度极高、融合阳性率极低，很难大规模获得稳定杂交瘤细胞株，极大限制牛单抗开发。

牛单 B 细胞技术不依赖细胞融合：直接从免疫牛外周血分离 PBMC，利用流式细胞术将抗原特异性记忆 B 细胞逐个分选至反应孔；裂解单细胞提取 mRNA，通过单细胞反转录与巢式 RT-PCR 扩增天然配对 VH、VL 序列；将可变区基因构建至 IgG 表达载体，哺乳动物细胞瞬时重组表达，获得完整牛源单克隆抗体。

2.牛超长 CDR3（ultra long CDR3）分子特征

与小鼠、人、骆驼抗体显著不同，牛免疫球蛋白重链 CDRH3 呈现三模态长度分布，部分抗体 CDRH3 氨基酸长度可达 40–70 个，该类序列被定义为超长 CDR3^[1]。

超长 CDRH3 能够自主折叠形成特征性结构，由 β 折叠构成的刚性茎区（stalk）与二硫键维系稳定的球形旋钮区（knob）组合而成；茎区向外伸展，顶端的旋钮区域构成核心抗原结合界面。病毒表面糖蛋白、膜蛋白往往被密集糖链包裹形成空间屏障，普通抗体难以接触抗原上保守的隐蔽表位，而超长 CDR3 可伸入糖链间隙识别此类隐匿位点，因此更易筛选获得具备广谱中和活性的高亲和力抗体^[2]。

二、牛单B细胞分选完整实验流程

图一 牛单B细胞筛选流程

1.抗原免疫与免疫效价评估

选择健康牛进行多次免疫，蛋白/多肽抗原配合佐剂多点注射；间隔免疫后采集血清，ELISA检测血清抗体效价，确认免疫应答达标后采血。

2.PBMC分离制备

无菌采集牛外周抗凝静脉血，密度梯度离心分离外周血单个核细胞PBMC；去除红细胞、细胞碎片，制备单细胞悬液；可通过磁珠预富集B细胞，降低后续流式分选压力。

3.多色荧光标记与流式单细胞分选（核心步骤）

图二 流式细胞术B细胞门控的三种策略^[3]

PBMC采用多参数染色策略：活细胞染料排除死细胞、CD3标记剔除T细胞、荧光标记抗原探针捕获抗原特异性B细胞；将单个阳性B细胞逐一分选至含裂解缓冲液的96孔PCR板，实现一孔单一细胞。

关键难点：针对牛源细胞优化特异性表面标志物抗体；同时兼顾抗原探针荧光强度，降低非特异性背景，提升阳性B细胞捕获率。

4.单细胞裂解与 RT-PCR 扩增抗体可变区

分选完成后细胞裂解释放mRNA；反转录合成cDNA；使用适配牛抗体基因的特异性引物，通过半巢式PCR分别扩增VH、VL序列。针对超长CDR3序列，优化长片段扩增体系，避免超长序列扩增丢失。

5.基因测序与表达载体构建

PCR产物测序，分析序列多样性，筛选携带超长CDR3的候选克隆；将VH、VL分别克隆至牛IgG重链、轻链真核表达载体[3]。

6.重组抗体瞬时表达与亲和纯化

重组质粒共转染HEK293F悬浮细胞，上清经过Protein A/G亲和层析纯化，获得完整牛源IgG单克隆抗体。

7.多维度功能鉴定

ELISA、Western Blot验证抗原结合；SPR/BLI测定平衡解离常数KD评价亲和力；开展中和实验、流式细胞结合实验评估生物学活性。

三、牛单B细胞技术优势与牛单抗应用场景

1. 牛单B细胞抗体制备技术核心优势

①突破传统杂交瘤技术瓶颈

牛杂交瘤融合效率极低，难以稳定获得阳性细胞株；单 B 细胞技术不需要细胞融合，直接克隆天然配对抗体基因，大幅缩短研发周期。

②发掘独特超长 CDR3 抗体资源

小鼠、兔几乎不产生超长 CDR3 抗体；牛源抗体独有的 stalk-knob 结构，靶向常规抗体无法识别的隐蔽保守表位，更容易获得广谱中和抗体。

③获得天然轻重链配对抗体

噬菌体展示文库会打乱 VH/VL 天然配对；单 B 细胞直接捕获体内原始配对组合，抗体特异性、亲和力更贴近体内真实状态，假阳性更低。

④易于筛选超高亲和力抗体

牛免疫系统经过多次免疫后可发生高效体细胞高频突变，筛选得到 KD 达到 pM 级别的高亲和力候选抗体。

⑤产物灵活改造

获得 VH/VL 序列后，可构建全长牛 IgG、scFv、Fab，单独表达 knob 结构域，也可开展抗体人源化改造，适配临床药物开发需求。

2. 主要应用场景

①基础免疫学研究

病原微生物抗原表位图谱解析、抗体免疫应答演化研究、B 细胞受体组库（BCR）多样性分析；探究超长 CDR3 结构与抗原识别机制，为抗体结构生物学提供研究材料。

②动物疫病临床诊断试剂开发

制备牛源单抗用于牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎、牛结核等病原 ELISA、免疫层析、免疫荧光检测试剂盒开发；牛源抗体与牛样本基质相容性更好，降低检测基质干扰。

③抗病毒生物药与创新治疗分子研发

针对流感、冠状病毒、HIV、疱疹病毒等高变异病原体开发广谱中和抗体；利用 knob 结构开发小型稳定多肽类候选药物；牛单抗经人源化改造后可作为人用治疗抗体先导分子。

④新型靶向分子开发

超长CDR3衍生 knob 结构分子量小、稳定性强，可作为靶向递送载体、小分子抑制剂骨架，拓展靶向药物开发思路。

四、卡梅德生物可提供的植物遗传转化服务内容与平台优势

1. 全套牛单 B 细胞单抗定制服务内容

①免疫方案定制与动物免疫

根据抗原类型（蛋白、多肽、灭活病毒）设计免疫程序，开展牛免疫；定期血清效价监测，确定最佳采血时间点。

②PBMC分离与流式单细胞分选

建立适配牛源免疫细胞的多色流式分选体系，优化抗原探针染色方案，分选抗原特异性单个 B 细胞；同步设置阴性对照降低假阳性。

③单细胞RT-PCR与基因克隆

采用牛特异性抗体引物库，优化超长 CDR3 长片段扩增体系；完成 VH/VL 测序、序列多样性分析，筛选 ultra long CDR3 阳性克隆；构建牛 IgG 真核表达载体。

④重组抗体表达纯化

HEK293F 悬浮细胞瞬时表达，Protein A 亲和纯化获得完整牛源单克隆抗体；同时支持scFv、Fab、knob 片段载体构建与表达。

⑤抗体活性系统鉴定

ELISA、WB、流式细胞结合检测；SPR/BLI 亲和力测定；病毒中和活性评估；提供完整标准化实验报告。

2.平台优势

①成熟适配牛超长 CDR3 扩增体系

针对 ultra long CDR3 序列扩增难点优化 PCR 方案，配备牛特异性引物库，有效避免超长序列扩增丢失，保障独特抗体资源不流失。

②完整保留天然 VH-VL 配对

严格执行单细胞一孔一细胞操作流程，区别于混合 B 细胞建库方案，最大程度保留体内天然轻重链配对，减少抗体活性丢失风险。

③多平台上下游联动

抗体序列获得后可同步承接抗体人源化、亲和力成熟、双特异性抗体构建、knob 结构单独表达等后续改造实验；可联动蛋白表达、病毒中和实验、结构生物学样品制备。

④多级标准化质控体系

载体全长测序、抗体序列验证、抗原结合活性、亲和力多重验证；所有实验流程可溯源，数据满足学术论文发表、专利申报需求。

⑤专业方案预判指导

提前评估抗原免疫原性、预判超长 CDR3 抗体获得概率；根据下游用途（诊断试剂 / 动物治疗 / 人源化药物先导分子）推荐最优筛选与改造策略。

参考文献：

[1]Huang R, Warner Jenkins G, Kim Y, et al. The smallest functional antibody fragment: Ultralong CDR H3 antibody knob regions potently neutralize SARS-CoV-2. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120(39):e2303455120. doi:10.1073/pnas.2303455120

[2]Dong J, Finn JA, Larsen PA, Smith TPL, Crowe JE Jr. Structural Diversity of Ultralong CDRH3s in Seven Bovine Antibody Heavy Chains. Front Immunol. 2019;10:558. Published 2019 Mar 22. doi:10.3389/fimmu.2019.00558

[3]Ramirez Valdez K, Nzau B, Dorey-Robinson D, et al. A Customizable Suite of Methods to Sequence and Annotate Cattle Antibodies. Vaccines (Basel). 2023;11(6):1099. Published 2023 Jun 14. doi:10.3390/vaccines11061099