动物免疫：抗体研发的首要关键环节｜从动物选择到效价检测全流程解析

动物免疫是抗体研发的首要且最关键的环节。若该环节出现问题，后续所有工作——无论是单克隆抗体还是多克隆抗体的抗体制备均将失去意义。而动物免疫不是单纯的“注射-等待-采集”，实验动物品类的选择、免疫量的多少、用哪种佐剂、中间间隔多久免疫，每一环节的决策都直接影响最终抗体的质量、亲和力与产量。一套科学合理的免疫策略，是抗体发现项目成功的基石。

本文从如何挑选合适的免疫动物和完整的免疫操作流程两个维度，系统梳理抗体发现中动物免疫策略的核心要点，为抗体制备提供从品系到效价的全流程参考。

一、免疫动物选择

1、小鼠

小鼠，尤其是Balb/c品系，是单克隆抗体制备的“金标准”模型。几乎所有用于杂交瘤融合的骨髓瘤细胞系都来源于Balb/c小鼠。在抗体发现的早期阶段，小鼠是最常用的免疫策略选择。主要适用于常规蛋白抗原的单克隆抗体制备。

Ø 小鼠周龄：通常选择6-8周龄Balb/c小鼠

Ø 免疫剂量：可溶性蛋白抗原首次免疫10-50μg/只

Ø 抗体产量：单鼠总采血量仅1-2ml，获IgG约0.5-10mg（因抗原类型和免疫方案而异）

Ø 免疫周期：3-4周即可首次采血

优点：繁殖周期短、饲养成本低、个体差异小、易于处理、可以对多种抗原产生良好的免疫反应。

不足：血清量少、抗体产量低，对保守抗原或自身抗原容易产生免疫耐受。

2、兔子

兔单克隆抗体通常具有更高的亲和力，部分研究中可达鼠源抗体的10-100倍。兔子能够产生高亲和力IgG抗体，且所有兔IgG都能与金黄色葡萄球菌蛋白A和链球菌蛋白G高效结合^[1]。

在抗体发现项目中，兔子主要适用于有高亲和力抗体需求、免疫组化等对灵敏度要求高的实验——当小鼠免疫策略无法满足亲和力要求时，兔子是优先考虑的替代方案。

Ø 品种：新西兰大白兔为主

Ø 免疫剂量：可首次免疫约100-500μg/只

Ø 抗体产量：单次采血10-20ml血清，获IgG约10-200mg

Ø 免疫周期：4-6周首次采血

优点：能够识别啮齿动物和人类抗原之间的表位，这些表位对啮齿动物单克隆抗体是不可见的、饲养成本低、易于处理、兔IgG无种属交叉反应干扰，适合检测人和小鼠样本。

不足：个体差异大。

3、羊驼

羊驼等骆驼科动物天然产生仅含重链可变区（VHH）的纳米抗体，纳米抗体分子量小（约15kDa）、稳定性高、组织穿透性强[2]，这一独特优势使羊驼免疫策略成为抗体发现领域近年来最受关注的前沿方向之一。

通过羊驼免疫获得的VHH抗体，可进一步构建噬菌体展示纳米抗体文库，实现高通量筛选。

Ø 羊驼周龄：28-36月龄

Ø 免疫周期：8-10周免疫5-7次

Ø 建库规模：有效库容量>10⁸

优点：能够天然产生纳米抗体、有高亲和力和特异性。

不足：个体差异大、实验成本高、实验周期长、存在免疫背景干扰风险。

图1：羊驼抗体肽结构域示意图

图2：羊驼免疫产生纳米抗体流程图^[2]

4、转基因动物

为解决鼠源抗体在人体内的免疫原性问题，转基因动物应运而生。这类抗体发现平台可在不经过人源化改造的情况下直接产生全人源单克隆抗体，极大加速了抗体制备的进程。

Ø OmniRat：传统人源化转基因小鼠产生人源抗体的效率远低于普通小鼠产生鼠源抗体的效率，其原因可能在于人源膜IgH链与小鼠细胞信号传导机制之间的兼容性不佳，所以构建了携带嵌合人源以及完全人源IgL基因座的OmniRat^[3]。

Ø OmniChicken：利用鸡与哺乳动物间较远的系统发育距离，针对高度保守的哺乳动物靶点打破免疫耐受，从而产生全人源序列抗体，尤其适用于小鼠或兔无法有效应答的靶标^[4]。

二、免疫流程设计

1、免疫前准备

（1）免疫动物选择：动物免疫必须使用SPF级动物，以确保抗体制备过程不受病原体干扰。

（2）抗原准备：

Ø 可溶性蛋白抗原：纯度需达95%以上，去除内毒素

Ø 多肽抗原（分子量<10kDa）：与载体蛋白偶联以增强免疫原性

Ø 小分子抗原（分子量<1kDa）：同样需与大分子载体偶联形成“半抗原-载体复合物”

Ø 跨膜蛋白：可选用胞外区重组蛋白、稳转细胞株或病毒样颗粒进行免疫

2、免疫方案设计

（1）佐剂选择

Ø 弗氏佐剂：很多研究使用在初次免疫中使用弗氏完全佐剂（CFA）

在加强免疫中使用弗氏不完全佐剂（IFA），抗原与佐剂按1:1比例乳化，形成“油包水”乳剂^[1]。

Ø 铝制佐剂：应用最广泛的人用疫苗佐剂，主要是氢氧化铝或磷酸铝。

Ø 脂质体：由磷脂双分子层组成的微型囊泡，可包封抗原。

Ø Montanide ISA 佐剂：基于矿物油或可代谢油的多种油包水（w/o）或水包油（o/w）乳液。

Ø Ribi 佐剂系统：含角鲨烯、Tween 80及分枝杆菌细胞壁组分，通过激活TLR通路增强免疫应答，炎症反应较CFA温和。

（2）免疫剂量

小鼠一般为10-50 μg/只[5]，大鼠为20-100 μg/只，兔子为100-500 μg/只，羊驼为200 µg - 1 mg/只，各阶段剂量需根据动物状态和抗体应答动态调整。

（3）免疫途径

Ø 皮下多点注射：选择小鼠背部4-6点，目的是增加抗原与免疫细胞接触面积

Ø 腹腔注射：操作简便，更适用于小鼠实验

Ø 肌肉注射：更适用于兔等大动物实验

Ø 静脉注射：仅用于可溶性、无毒性抗原

（4）效价检测

加强免疫后7–10天，抗体水平通常达到峰值，此时可通过采血获取微量血清进行效价检测。效价检测的核心目的是评估免疫应答是否达到预期水平，以此决定是否需要追加免疫以及何时进行脾细胞融合或采全血。

效价检测最常用的方法是间接酶联免疫吸附试验。其基本原理为：将已知抗原吸附于固相载体表面，加入梯度稀释的待测血清，若血清中含有特异性抗体，则与固相抗原结合；再加入酶标记的抗种属二抗（如抗小鼠IgG-HRP），通过底物显色反应测定吸光度值，吸光度值与抗体浓度成正比。

动物免疫是抗体开发成败的关键。本文从动物选择与流程设计两方面梳理策略：Balb/c小鼠是金标准，兔亲和力高，羊驼产纳米抗体，转基因动物攻克人源化与保守靶点难题；免疫需注意抗原纯度、佐剂选择、因种而异的剂量及途径，每个环节均影响最终抗体质量。 

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常见问题

1. 为什么弗氏完全佐剂（CFA）只能用于首次免疫，不能用于加强免疫？

CFA含有灭活的结核分枝杆菌，能强力激活细胞免疫，但也会引起严重的局部炎症、肉芽肿甚至溃疡。重复使用会导致副作用累积，且过度炎症反而可能干扰加强免疫效果。加强免疫通常改用不含分枝杆菌的弗氏不完全佐剂（IFA），既可继续刺激免疫应答，又避免严重副作用。

2. 动物免疫后抗体水平低，除了抗原质量问题，还有哪些可能原因？

Ø 免疫耐受：抗原与宿主亲缘关系太近机体将其识别为“自身”成分而不产生应答

Ø 佐剂不匹配：不同佐剂诱导的免疫应答类型不同

Ø 免疫途径不当：皮下、腹腔、肌肉、静脉注射诱导的免疫应答强度和类型有差异

Ø 免疫间隔不合理：间隔太短（<1周）B细胞未充分活化；间隔太长（>1月）记忆细胞可能衰退

Ø 动物个体差异：即便同品系、同周龄，不同个体的免疫应答能力也可能相差数倍。 

3. 什么是免疫耐受？如何克服？

免疫耐受是机体对特定抗原不产生免疫应答的状态。在抗体开发中，当目标抗原为自身蛋白或高度保守蛋白时，免疫动物常因免疫耐受而无法产生有效抗体。克服策略包括：

Ø 选择亲缘关系更远的动物

Ø 采用转基因动物平台

Ø 使用强效佐剂打破耐受

Ø 设计嵌合或突变抗原

4. 抗原与佐剂乳化是否完全，如何判断？

将制备好的乳化剂滴入冷水中——若保持完整不分散，成滴状浮于水面，说明乳化完全，为合格的“油包水”乳剂。若乳剂在水中散开，说明乳化不完全，需重新制备。乳化方法主要有两种：

Ø 研磨法：适用于大量制备，但抗原损失较大

Ø 注射器混合法：两注射器通过细胶管相连交替推注，易于无菌操作。

5. 动物免疫实验需要考虑哪些伦理问题？

动物福利伦理委员会（IACUC）要求：

Ø 佐剂使用必须经伦理批准

Ø 能引起严重反应的佐剂（如CFA）必须有科学合理性

Ø 若目标仅为产生常规抗体，应优先选择炎症反应较轻的佐剂（如铝佐剂、Ribi等）

Ø 需评估实验动物的系统性疼痛和痛苦。

参考文献

[1]Yam PC, Knight KL. Generation of rabbit monoclonal antibodies. Methods Mol Biol. 2014;1131:71-9. doi: 10.1007/978-1-62703-992-5_5. PMID: 24515460.  

[2]Eyssen LE, Ramadurai S, Abdelkarim S, Buckle I, Cornish K, Lin H, Jones AK, Stephens GJ, Owens RJ. From Llama to Nanobody: A Streamlined Workflow for the Generation of Functionalised VHHs. Bio Protoc. 2024 Mar 20;14(6):e4962. doi: 10.21769/BioProtoc.4962. PMID: 38841291; PMCID: PMC10958182.  

[3]Osborn MJ, Ma B, Avis S, Binnie A, Dilley J, Yang X, Lindquist K, Ménoret S, Iscache AL, Ouisse LH, Rajpal A, Anegon I, Neuberger MS, Buelow R, Brüggemann M. High-affinity IgG antibodies develop naturally in Ig-knockout rats carrying germline human IgH/Igκ/Igλ loci bearing the rat CH region. J Immunol. 2013 Feb 15;190(4):1481-90. doi: 10.4049/jimmunol.1203041. Epub 2013 Jan 9. Erratum in: J Immunol. 2013 Jun 15;190(12):6707. PMID: 23303672; PMCID: PMC3566577.

[4]Ching KH, Keating S, Zeng B, Espinosa DA, Stack E, Wall S, Beyer S, Wade J, Tam A, Cunningham O, Chowdhury R, Zhang Y, Morales J, Abdiche Y, Leighton PA, Darmanin Sheehan A, Harriman W. Generation of human sequence antibodies in OmniChicken against the highly conserved mammalian target BDNF using three distinct discovery workflows. MAbs. 2026 Dec;18(1):2672771. doi: 10.1080/19420862.2026.2672771. Epub 2026 Jun 4. PMID: 42237848; PMCID: PMC13240955.

[5]Zheng J, Zhang H, Bao K, Gao W, Xu C, Xia C. Preparation of Monoclonal Antibodies Against Bovine Progesterone. Monoclon Antib Immunodiagn Immunother. 2015 Aug;34(4):275-7. doi: 10.1089/mab.2015.0001. PMID: 26301932.