一、哺乳动物细胞转染介绍

1. 定义

哺乳动物细胞转染是将携带目的重组蛋白基因的外源质粒DNA导入真核哺乳动物细胞（HEK293、CHO等），借助细胞自身转录翻译系统合成重组蛋白的核心分子生物学技术，是哺乳系统重组蛋白表达、抗体制备、靶点功能验证的基础操作。区别于原核转化、病毒感染，转染多指非病毒介导的外源核酸递送，分为瞬时转染与稳定转染两大类型。

2. 两大转染类型

Ø 瞬时转染（Transient Transfection）

重组质粒转染细胞（293F、CHO），外源质粒仅进入细胞质/细胞核，不整合到细胞基因组，细胞分裂时质粒会逐步丢失^[1,2]；转染后3–7天为蛋白表达高峰期，7天后表达量显著下降。

优点：实验周期短、操作简单、成本低、无需筛选；

适用：小量重组蛋白哺乳表达快速制备、蛋白互作、酶活筛选、突变体高通量验证；

缺点：无法长期稳定生产，批次表达量波动大，不适合大规模长期发酵。

Ø 稳定转染（Stable Transfection）^[2]

重组蛋白CHO或293F稳定表达细胞系构建和筛选，外源DNA随机整合至细胞染色体基因组，通过抗性筛选获得稳定细胞株，细胞持续传代均可稳定表达目标蛋白。

优点：可无限传代、表达水平稳定、适配大规模工业化发酵，是治疗性蛋白、抗体药物生产标准工艺；

适用：重组药物、长效量产蛋白、动物体内长效功能实验；

缺点：构建周期长达1–3个月，筛选、单克隆化流程繁琐，前期研发成本高。

二、哺乳动物细胞转染方法分类及各自优势

1. 脂质体转染

机制：阳离子脂质体带正电，静电结合带负电质粒DNA形成纳米复合物；吸附于细胞膜后通过胞吞进入细胞，依靠质子海绵效应逃离内体，释放DNA入核完成表达^[3]。

如图一为脂质体递送基因的途径。①直接融合途径：与质膜立即融合，遗传物质的直接细胞质释放，绕过内体区室化。②内体融合逃逸：通过胞吞进行内部吞，与内体膜融合，基因货物的受控释放，膜合并保持隔间完整性。③内体破裂通路：脂质的pH依赖性电离，渗透压积累，内体膜不稳定和破裂，囊泡内容物的批量释放。

图一 脂质基因递送载体的结构及细胞进入机制^[4]

优势：操作温和、细胞毒性可控；贴壁/悬浮细胞通用；商业化试剂盒成熟、重复性好；无需专用设备；适配瞬时转染快速制备哺乳表达的重组蛋白、膜蛋白。

2. PEI聚乙烯亚胺转染

高分子阳离子聚合物递送核酸，适配大规模悬浮HEK293/CHO摇瓶、生物反应器瞬转^[5]。

优势：试剂成本极低、可线性放大至百升级发酵；转染效率稳定，是中试重组抗体、分泌蛋白批量生产标准方案；仅需常规摇床，无设备门槛。

3. 电转染（电穿孔）

瞬时高压脉冲击穿细胞膜形成临时微孔，质粒直接进入胞内^[1]。

优势：不受血清、培养基抑制剂干扰；对原代细胞、难转染稳定CHO株转染效率显著高于脂质体；适合稳定细胞株单克隆构建。

短板：细胞死亡率高、需专用电转仪，难以放大发酵。

4. 病毒转导

依托病毒载体递送基因，整合效率极强^[1]。

优势：可递送毒性致死膜蛋白、难表达靶点；整合效率高，稳定株构建周期短。

短板：存在生物安全风险，GMP药物生产受限；操作流程复杂、成本高。

三、常规脂质体转染法详细实验流程

1. 实验试剂

高纯度无内毒素质粒（内毒素＜0.1 EU/μg）、Lipofectamine 3000/2000、Opti-MEM无血清培养基、完全DMEM（10%胎牛血清，无双抗）、PBS缓冲液。

2. 实验步骤

Ø 步骤1：转染前细胞铺板准备

复苏50代以内、活力＞95%的对数生长期HEK293细胞，消化计数；6孔板每孔接种1.2–1.5×10⁵个细胞，加入2 mL无抗生素完全培养基；37℃、5% CO₂孵箱培养18–24 h，转染当日细胞密度控制在70%–80%；

质控要求：细胞无支原体污染、无大面积漂浮死亡，培养基无浑浊；全程禁止添加青霉素/链霉素，转染阶段抗生素会大幅提升细胞毒性、降低转染效率。

Ø 步骤2：转染复合物配制（全程室温，严格控时）

准备2支无菌1.5 mL聚苯乙烯离心管；

A管（稀释脂质体）：125 μL Opti-MEM + 4 μL Lipofectamine 3000，轻柔吹打混匀，室温静置5 min（必须满5 min，脂质体充分分散）；

B管（稀释质粒）：125 μL Opti-MEM + 2 μg 无内毒素质粒，轻柔混匀；

混合复合物：将A管脂质稀释液逐滴加入B管质粒稀释液，轻柔吹打3–5次（禁止剧烈涡旋、产生气泡），室温静置15–20 min；

时间红线：静置＜15 min复合物未完全组装；若静置＞20 min脂质- DNA聚集沉淀，转染效率断崖下降。

Ø 步骤3：细胞换液与转染孵育

吸弃孔板原有完全培养基，PBS轻柔清洗细胞1次，每孔加入1 mL纯Opti-MEM无血清培养基；

将250 μL复合物均匀滴加至孔内，缓慢十字摇晃培养板混匀；

放入37℃ CO₂孵箱孵育4–6 h：

4 h即可完成核酸入胞；毒性蛋白、膜蛋白控制4 h提前换液，降低脂质体损伤；普通可溶性蛋白可孵育6 h，提升转染效率。

Ø 步骤4：换液与蛋白表达培养

孵育结束后，吸弃含复合物的Opti-MEM，每孔更换2 mL新鲜无抗生素完全培养基；37℃继续培养：

分泌型重组蛋白：转染后48–72 h收集细胞上清；

胞内/膜蛋白：转染后48 h收集细胞沉淀；

高毒性膜蛋白：可调整培养温度至30℃，降低细胞凋亡、提升蛋白可溶性。

Ø 步骤5：样品收集与下游纯化

上清样本：0.45 μm滤膜过滤后直接亲和纯化；

细胞沉淀：裂解液冰上裂解，提取膜蛋白或胞内蛋白。

四、脂质体转染的问题与注意事项

1. 转染效率极低，几乎无蛋白表达

主要原因：质粒内毒素高/降解；复合物静置时间过长聚集；转染时培养基含血清/双抗；细胞汇合度过密/过稀

措施：重新提取无内毒素质粒；严格控制复合物静置15–20 min；换无血清、无抗培养基配制复合物；铺板控制密度在70%-80%。

2. 转染后大量细胞漂浮死亡

主要原因：脂质体/质粒配比过高；孵育超过6 h未换液；质粒带毒性；抗生素残留。

措施：梯度优化DNA，脂质体比例（1:2~1:4）；4 h提前更换完全培养基；低温30℃培养；全程无抗培养。

3. 显微镜下细胞表面出现白色颗粒沉淀

主要原因：EDTA浓度过高、脂质过量、质粒不纯。

措施：用PBS或新鲜完全培养基重悬洗涤1次，彻底洗掉残留的EDTA；减少脂质试剂用量，重新纯化质粒。

4. 批次间转染结果重复性差

主要原因：细胞传代周期不稳定、复合物孵育时长波动、培养基批次差异。

措施：固定铺板密度与孵育时间，统一培养基。

5. 膜蛋白几乎检测不到可溶性产物

主要原因：膜蛋白本身自带细胞毒性，脂质体加剧膜疏水毒性，细胞提前凋亡。

措施：缩短复合物孵育至4 h；低温诱导；共表达分子伴侣帮助蛋白折叠减少沉淀；搭配分泌信号肽表达胞外段。

五、卡梅德哺乳表达体系服务与核心优势

1. 全套服务内容

覆盖瞬时转染蛋白表达、稳定细胞株构建、重组蛋白纯化、多维度质检全流程：

①上游：基因密码子优化、自主高表达载体构建；

②细胞平台：FreeStyle 293-F 细胞系、Expi 293-F细胞系、Expi-CHO-K1和Expi CHO-S等细胞系；

③转染工艺：脂质体瞬时转染、PEI悬浮大规模瞬转、稳定株筛选；

④下游：多标签（His/Fc/SUMO）亲和纯化、内毒素去除、SDS-PAGE/HPLC/细胞活性全套质检，交付完整可追溯实验记录文件。

2. 核心技术优势

①载体优化，表达量领先

自主改造CMV高表达骨架，搭配定制分泌信号肽，可以做到高达6.3g/L表达水平的重组抗体发酵，适合于重组单抗药物的高水平表达。

②完善细胞培养与质控体系

全部采用无血清专用培养基，细胞严格控制传代次数、每月支原体筛查；团队具备GMP药物开发经验，所有实验流程符合规范，数据、记录完整可用于药物注册申报。

③多类型蛋白定制化方案

可承接分泌型细胞因子、全长单抗、多亚基复合物、人源跨膜受体、病毒包膜蛋白、毒性重组蛋白；支持标签切除、生物素标记、同位素标记等个性化修饰需求。

④规模化生产能力

配套完整发酵、纯化生产线，既能提供实验室微克级小样，也可承接临床前中试百升级量产，一站式完成从基因序列到高活性纯蛋白的全部实验。

参考文献：

[1] Fus-Kujawa A, Prus P, Bajdak-Rusinek K, Teper P, Gawron K, Kowalczuk A, Sieron A L. An Overview of Methods and Tools for Transfection of Eukaryotic Cells in vitro[J]. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2021, 9: 701031.

[2] Hacker D L, Kiseljak D, Rajendra Y, Thurnheer S, Baldi L, Wurm F M. Polyethyleneimine-based transient gene expression processes for suspension-adapted HEK-293E and CHO-DG44 cells[J]. Protein Expression and Purification, 2013, 92(1): 67-76.

[3] Amin M, Mansourian M, Koning G A, Badiee A, Jaafari M R, Ten Hagen T L M. Development of a novel cyclic RGD peptide for multiple targeting approaches of liposomes to tumor region[J]. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society, 2015, 220(Pt A): 308-315.

[4] Pavlov R V, Akimov S A, Dashinimaev E B, Bashkirov P V. Boosting Lipofection Efficiency Through Enhanced Membrane Fusion Mechanisms[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2024, 25(24): 13540.

[5] Hederoth G, de la Rosa A, Godec A, Aguilar X, Napoleone A, Petrovic A, Metzendorf N G, Hultqvist G. Updated transient gene expression protocol in Expi293F cells using PEI[J]. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, [2026], 13: 1661193.

Q1：脂质体转染有哪些核心注意事项？

1. 质粒质量硬性标准：必须使用转染级无内毒素质粒，内毒素超标会引发细胞大面积凋亡、抑制蛋白表达；TE缓冲液EDTA浓度＜0.3 mM，螯合剂会破坏脂质- DNA电荷复合物；

2. 全程规避抑制剂：复合物配制仅用无血清Opti-MEM，血清、肝素、抗生素、磷酸盐会竞争结合阳离子脂质，瓦解复合物；

3. 试剂储存：脂质体4℃避光保存，严禁冷冻、室温长期放置，氧化失效后转染效率归零；

4. 操作轻柔：脂质体、质粒混匀禁止涡旋，剧烈震荡会破坏脂质双层结构；

5. 细胞状态：选用低代、对数生长期细胞；每月定期检测支原体污染。