酶是一种由生物体产生的高效、专一的生物催化剂，在抗体发现和酶工程改造中均扮演着不可替代的角色。在传统酶制剂的生产中，操作复杂、成本高、酶活损失大；而在固定化应用时，传质阻力问题长期未得到根本解决^[1]。

在这一情况下，细胞表面展示技术应运而生，与传统的酶固定化方法相比，细胞表面展示技术具有催活性高、较为温和且易于制备的显著优势。在诸多展示宿主中，酵母表面展示（Yeast Surface Display, YSD）凭借其独特的真核表达优势，已成为酶工程领域最具活力的技术平台之一^[2]。自1997年Wittrup团队首次建立以来，YSD在蛋白质工程的高通量展示方法中持续占据核心位置。

一、酵母表面展示的技术原理

酵母表面展示（Yeast Surface Display, YSD）的技术原理就是将目标酶与酵母细胞系蛋白融合表达，借助天然的蛋白转运机制将其锚定于细胞膜外表面。一个完整的YSD系统主要包含三大要素：展示宿主、锚定蛋白和目标酶^[3]。YSD流程主要涵盖：文库构建→酵母转化与同源重组→诱导表达与表面展示→磁珠初筛→流式精筛→测序鉴定→亲和力成熟→可溶性验证，形成了一个完整的发现-筛选-优化-验证闭环^[4]。

图1：酵母展示工作原理及流程图^[4]

二、酵母表面展示的独特优势

1、真核表达系统

酵母是一种真核生物，具备完善的蛋白折叠机制和翻译后修饰能力，包括二硫键的形成、糖基化修饰等。采用能够进行翻译后修饰的真核表达机制，这种能力促进了大型或复杂蛋白质的折叠和分泌，解决了噬菌体或细菌展示系统中可能遇到的挑战^[3]。

2、免去纯化与固定化

传统酶工程研究中，通常需要经历表达、纯化、固定化等多个环节，而酵母表面展示（Yeast Surface Display, YSD）技术则将表达与固定化合二为一——酶在表达的同时即被锚定于细胞表面，无需单独的纯化和固定化步骤^[1]。

3、底物易于进入、产物易于脱离的动力学优势

在传统的固定化酶体系中，酶不是裸露在外的，而是被藏在载体内部孔径或者三维网状结构中，底物和产物往往需要克服显著的传质阻力。相比之下，酵母表面展示的酶直接暴露于细胞外表面，底物可以无障碍地接近酶活性中心，产物也能迅速扩散离开，从而在动力学上具有天然优势。

4、高通量筛选的天然适配性

酵母表面展示（Yeast Surface Display, YSD）技术的另一独特优势在于其与流式细胞分选（FACS）技术的天然适配性。由于目标酶展示在细胞表面，可以通过荧光标记的底物、抗体或产物来监测酶的活性或结合能力，进而利用FACS对展示有不同酶突变体的酵母细胞进行高通量分选。

图2：多种蛋白质展示系统对比^[5]

三、酵母表面展示技术在酶工程中的核心应用

1、定向进化与高通量筛选

定向进化是酶工程中强大的工具之一，定向进化的本质是模拟其自然选择并加速其发展进程，他的技术难点在于筛选。精准选择优异变体是工程中亟待解决的问题。然而酵母表面展示（Yeast Surface Display, YSD）技术为这一过程提供了一个理想的操作平台，Mikolajczyk等人开发了酶-底物共展示的策略，通过FACS高效分离高活性突变体^[6]。

2、多酶共展示与协同催化

许多重要的生物转化过程涉及多步酶促反应，传统策略是将多种游离酶混合在系统中使用，这会导致间产物依赖缓慢的扩散在酶活性位点之间传递，效率低下且易造成中间产物的积累或损失^[7]。酵母表面展示（Yeast Surface Display, YSD）技术为构建多酶级联反应系统提供了很好的解决方案：将多步反应所需的酶共同展示在同一酵母细胞表面，通过空间上的邻近效应实现“底物通道”效应。从而增强了酶-酶的接近性和底物通道，解决了传统多酶系统的关键局限性，提高展示效率，显著提高了系统的催化性能^[7]。

图3：构建支架介导双酶展示系统流程图^[7]

3、全细胞催化剂的稳定性提升

酶在生产条件下的稳定性是制约其规模化应用的关键因素。酵母表面展示（Yeast Surface Display, YSD）技术通过将酶锚定于细胞壁这一天然的保护性基质上，显著提升了酶的热稳定性和pH耐受性。

四、卡梅德生物：您的酵母研究伙伴

酵母表面展示（Yeast Surface Display, YSD）正在深刻改变酶工程的研究范式——从“游离”走向“锚定”，从“低通量”走向“高通量FACS筛选”，从“单酶”走向“多酶协同”。然而，研究者仍面临锚定蛋白选择、展示载体优化等诸多挑战。

卡梅德生物拥有成熟的酵母表面展示技术平台和酵母表达系统服务，结合FACS高通量筛选能力，致力于为科研工作者提供从技术咨询到实验实施的全方位解决方案。

[1]Zhang B, Gao X, Zhou Y, You S, Qi W, Wang M. Surface Display Technologies for Whole-Cell Biocatalysts: Advances in Optimization Strategies, Food Applications, and Future Perspectives. Foods. 2025 May 19;14(10):1803. doi: 10.3390/foods14101803. PMID: 40428582; PMCID: PMC12111073.

[2]Li Z, Zhang B, Liu M, Deng C, Wu X, Wang L, Verstrepen KJ, Zhao G, Zhang Y. CEN-Display: Construction and optimization of a surface display system in Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C. Bioresour Technol. 2026 Jun 8;458:135113. doi: 10.1016/j.biortech.2026.135113. Epub ahead of print. PMID: 42264410.

[3]Li Y, Wang X, Zhou NY, Ding J. Yeast surface display technology: Mechanisms, applications, and perspectives. Biotechnol Adv. 2024 Nov;76:108422. doi: 10.1016/j.biotechadv.2024.108422. Epub 2024 Aug 6. PMID: 39117125.

[4]Zajc CU, Sylvander E, Teufl M, Traxlmayr MW. Protein Engineering by Yeast Surface Display. J Vis Exp. 2024 Nov 29;(213). doi: 10.3791/66994. PMID: 39671346.

[5]Kizerwetter M, Pietz K, Tomasovic LM, Spangler JB. Empowering gene delivery with protein engineering platforms. Gene Ther. 2023 Dec;30(12):775-782. doi: 10.1038/s41434-022-00379-6. Epub 2022 Dec 19. PMID: 36529795; PMCID: PMC10277311.

[6]Mikolajczyk BM, Golinski AW, Hackel BJ. Enzyme-substrate co-display on yeast empowers engineering of tobacco etch virus protease activity. Protein Eng Des Sel. 2025 Jan 10;38:gzaf011. doi: 10.1093/protein/gzaf011. PMID: 41001844; PMCID: PMC13010152.

[7]Zhou C, Chen F, Leng J, Liang C, Sha Y, Sun W, Niu H, Chen Y, Ying H. Construction of a scaffold-mediated dual-enzyme display system in Komagataella phaffii with immobilized cells for continuous biocatalysis. Bioresour Technol. 2026 Jul;452:134527. doi: 10.1016/j.biortech.2026.134527. Epub 2026 Apr 4. PMID: 41942042.

关于酵母表面展示，你最关心的5个问题！

1、什么是“基因型-表型偶联”？为什么它很重要？

基因型-表型偶联是指每个酵母细胞内部的基因（编码特定酶突变体）与其表面展示的蛋白（该基因的表达产物）之间存在物理上的对应关系。当你在细胞表面检测到高活性的酶时，就可以直接“追溯”到该细胞内部的基因序列。这种偶联关系使得“筛选-测序-验证”的工作流程极为高效——你筛选到的是“活细胞”，而不仅仅是“蛋白”，因此可以直接扩增阳性克隆的基因用于下一轮进化。

2、为什么YSD的展示效率会受到目标蛋白分子大小的影响？

酵母细胞壁锚定蛋白的转运能力有限，目标蛋白越大，融合蛋白在分泌途径中越容易遭遇折叠异常或空间位阻问题。中国科学院天津工业生物技术研究所开发的CEN-Display平台，通过引入超长刚性连接肽来缓解空间位阻，成功将大分子酶β-葡萄糖苷酶（BGL1）展示在酵母表面。一般来说，分子量较小的蛋白（如纳米抗体、小分子酶）展示效率更高，而超100 kDa的大蛋白则需要特殊优化。

3、你说YSD“免去纯化与固定化步骤”，但酵母细胞本身也会带来背景反应或干扰吧？

确实，全细胞催化剂不能完全等同于纯化酶——酵母细胞自身的代谢产物和细胞壁成分可能在某些反应体系中产生背景干扰。然而，在绝大多数酶催化反应中，这种背景干扰是可以忽略不计的，原因有三：

Ø 酵母细胞在反应前通常经过热处理或洗涤，灭活内源酶活性；

Ø 目标酶展示在细胞外表面，其催化活性远高于细胞自身的背景活性；

Ø YSD节省的成本和时间（无需纯化、无需化学固定化）远超其带来的微小背景代价。对于要求极高纯度的医药应用场景，也可以通过简单的离心洗涤进一步降低背景。

4、FACS筛选的“高通量”到底有多高？能筛选多少个突变体？

流式细胞分选（FACS）的典型通量为每秒检测104个细胞，每小时可分选约107个细胞。对于酶突变体文库筛选，通过荧光标记的底物或产物来监测单细胞水平的酶活性，FACS可以在几个小时内完成对106-108个突变体的检测和分选。这一通量是传统96孔板筛选（每天约103个样品）的数万倍，使得从庞大文库中“钓出”极少数性能优异变体成为可能。

5、YSD制备的“全细胞催化剂”可以重复使用多少次？

可重复使用性因酶种和反应条件而异。一般而言，YSD全细胞催化剂通过简单的离心即可回收，在温和反应条件下（如30-40°C、中性pH）可以重复使用5-10次而保持50%以上活性。通过SSA系统固定的有机磷水解酶在6次重复使用后仍保留77.7%的活性。然而，在高温、有机溶剂或机械搅拌等苛刻条件下，酵母细胞本身的完整性和酶分子的锚定稳定性会受到影响，重复使用次数相应减少。对于工业化应用，通常需要在催化效率和操作寿命之间做出权衡。