基于以上现状，越来越多的研究学者就p53基因治疗开展了一系列的研究，其中北京大学深圳医院男性生殖与遗传重点实验室的桂耀庭等两人共同通讯在《Theranostics》（IF=13.3）发表题为“Synthesis of RNA-based gene regulatory devices for redirecting cellular signaling events mediated by p53”的研究论文，该研究开发了一种新型高效的p53特异性识别核酶开关，为aptazyme与细胞蛋白的结合提供了一种模块化策略，并通过与其他合成生物工具的联合应用成功抑制了肿瘤生长，为肿瘤治疗提供了新的视角。

此研究通过SPR实验验证了p53 RNA适配体序列与p53蛋白有较强的结合作用，p53适体酶能有效地感知野生型p53蛋白并启动细胞内的自切割，基于p53适体酶设计的Cre-p53适体酶基因电路和dCas9-VP64/sgRNA介导的基因电路能显著抑制野生型p53-p53细胞的生长并促进其凋亡。此外，该基因序列在体内对肿瘤也具有显著的抑制作用。

研究成果

1. p53适体酶的构建及鉴定

为了研究p53蛋白是否能与适体酶结合并调节锤头状核酶的活性，该研究中构建了p53应答性核酶开关（p53 aptazyme）。结果表明，在缺少p53的情况下，适配体和锤头状sTRSV核酶的结合阻止了其切割活性；然而，在p53存在下，锤头状核酶的环结构被恢复，并且切割活性被激活。

图1 p53 aptazyme的构建及鉴定

此研究使用三种p53野生型细胞系HEK 293 T（人胚肾细胞）、HCT 116 p53+/+（人结肠癌细胞）和原代培养的HFF（人包皮成纤维细胞）来测试适体酶是否可以感测内源性p53。通过比较实验组和对照组之间的相对荧光来评估适体酶的效率。最后发现只有53 aptazyme 1可以传递适体-配体结合信号。

用p53 aptazyme 1对4种细胞进行荧光素酶测定分析发现，p53 aptazyme 1组的相对hRluc荧光素酶活性在HFF、293 T和HCT 116 p53+/+细胞中显著降低，但在p53突变细胞中没有降低。然而，在p53突变细胞中过表达野生型p53蛋白时，相对hRluc荧光素酶活性也显著降低。这些结果表明，合成的p53 aptazyme 1可以有效地感知野生型p53蛋白并启动自切割。

图2 适体酶感测内源性p53测试

2.基于p53-aptazyme装置的Cre-LoxP介导基因线路的构建

为了对肿瘤细胞产生杀伤作用，此研究用Cre-LoxP系统组装了核酶开关（p53 aptazyme 1），该系统通常用于遗传途径修饰。在该基因线路中，当野生型p53蛋白结合p53适配体时，核酶被激活，融合转录物Cre-核酶适体降解并产生EGFP。相反，p53突变细胞中的核酶保持失活，LoxP位点被剪接，导致EGFP下游白喉毒素的产生。通过这种设计，基因线路实现了p53传感和肿瘤细胞靶向杀伤。

图3 基于p53-aptazyme装置的Cre-LoxP介导基因线路的构建

3.Cre-p53适体酶基因线路抑制野生型p53缺陷肿瘤细胞生长和促进其凋亡

为了研究Cre-p53适体酶基因回路是否可以抑制p53缺陷型肿瘤，作者用裸鼠构建了肿瘤模型。结果表明，Cre-p53 适体酶系统有效地减小了注射p53缺陷细胞的裸鼠的肿瘤大小，但对注射野生型细胞的裸鼠没有效果，从不同测定获得的数据验证了P53适体酶装置在Cre-LoxP系统中的作用，其可以特异性识别p53并诱导p53缺陷细胞中的细胞凋亡。

图4 Cre-p53适体酶基因线路抑制野生型p53缺陷肿瘤细胞生长和促进其凋亡

4.基于p53-aptazyme装置的dCas9-VP64/sgRNA介导基因线路的构建

基因回路的简化有利于载体的传递效率和系统的稳定性。Cre适体酶相对较大，需要两种载体而不是单一载体来递送癌症特异性杀伤系统，另一方面，CRISPR系统可以通过构建载体来实现癌症特异性杀伤功能，作者团队开发了一种dCas9-VP64工具，可以有效地激活野生型-设计的表达CRISPR-dCas9和p53适体酶的电路在质粒上编码。在野生型p53细胞中，核酶被激活，并且dCas9-VP64融合基因被失活；在野生型p53缺陷细胞中，p53蛋白被dCas9-VP64过表达。

图5 CRISPR-p53适体酶介导的细胞凋亡

5.dCas 9-VP 64/sgRNA-p53适体酶开关在体外和体内抑制野生型p53缺陷细胞的生长并促进其凋亡

为了验证野生型p53表达的激活，dCas 9-VP 64/sgRNA-p53适体酶质粒被转染到几种细胞系中。在G361、SCL 1和HeLa细胞中，等位基因座处的野生型p53被dCas 9-VP 64激活，并且细胞生长被抑制。

将质粒包装到慢病毒中并转导到癌细胞系中构建裸鼠肿瘤细胞移植模型，结果表明，该系统有效地减小了注射p53缺陷细胞（G361，SCl-1和HeLa）的小鼠的肿瘤大小。

基于这些发现，作者提出dCas9-VP64-p53开关可以感测野生型p53并在p53缺陷型癌细胞中诱导凋亡。

图6 CRISPR-p53适体酶系统在体外和体内抑制了几种野生型p53缺陷细胞的增殖

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