一．文献背景

1.2型糖尿病（Type-2 Diabetes Mellitus，T2 DM）

2型糖尿病发病率高、并发症多、治疗困难，是目前最受关注的公共卫生问题之一。人胰岛淀粉样多肽（hIAPP）与2型糖尿病（T2DM）密切相关，因为其异常的自组装导致膜损伤和细胞功能障碍，开发潜在的抑制剂来预防hIAPP纤维化是干预和治疗糖尿病的有希望的策略。

2.人胰岛淀粉样多肽（hIAPP）

hIAPP是指胰腺β细胞分泌的一种激素，由37个氨基酸组成;它可以穿过血脑屏障，激活脑中的特异性受体，抑制胰高血糖素释放，并在维持葡萄糖稳态中发挥关键作用。然而，hIAPP的错误折叠在异常条件下形成有毒寡聚体和淀粉样纤维，从而破坏膜屏障，导致β细胞死亡。同时，胰淀素可在心、脑、肾等重要器官中蓄积，从而引起更严重的并发症。最近的许多研究都集中在hIAPP上，以抑制其聚集并找到预防和治疗T2 DM的有效候选药物。

3.研究方向

天然异喹啉生物碱被用作针对不同生物分子的有效药物。尽管研究探索了黄连素，药根碱和白屈菜红碱在糖尿病中的功效，但其潜在机制仍不清楚。

基于以上现状，中国人民大学化学系杜为红老师为通讯作者在ACS Chemical Neuroscience（IF=5.78）发表题为“Exploration of Isoquinoline Alkaloids as Potential Inhibitors against Human Islet Amyloid Polypeptide”的研究论文，该文中选择三种异喹啉生物碱来揭示它们在hIAPP聚集、解聚和细胞保护中的作用。三种化合物均能有效抑制多肽纤维化，使原纤维分散成小的寡聚体和大部分单体，并通过抑制hIAPP寡聚化而上调细胞活力。

4.三种异喹啉生物碱的区别

▶小檗碱（BBR）

小檗碱因其分布广泛和药理作用而受到广泛关注，近年来对BBR的研究主要集中在其在神经退行性疾病中的多靶点潜力，BBR影响胆碱酯酶和单胺氧化酶的生物学功能，以及β淀粉样蛋白（Aβ）的聚集与AD相关。此外，BBR是黄连生物碱的主要降血糖成分，可促进胰岛β细胞的修复，提高肝细胞对葡萄糖的利用，对糖尿病小鼠和患者的降血糖作用已被证实。

▶药根碱（JAT）

药根碱（JAT）是BBR的代谢产物，具有相同的四环骨架，可通过打开BBR末端的含氧五元环获得。末端羟基修饰增加了JAT的极性，这可能与BBR在体内的生理活性有关。JAT也是黄连中的主要降糖成分，可特异性结合α-葡萄糖苷酶。

▶白屈菜红碱（CHE）

白屈菜红碱（CHE），是传统天然药用植物白屈菜中的活性成分，具有明显的抗肿瘤、抗菌、抑菌、清热和解毒活性。CHE与BBR的不同之处在于前者具有苯并[c]菲啶结构。2号环上的N原子被甲基化，因此降低了该化合物的极性。CHE被用作靶向胆碱酯酶和Aβ聚集的新型双功能支架。由于其与PPARγ的潜在结合，可以改善胰岛素敏感性。

图1 三种异喹啉生物碱的区别

二．研究成果

1. 异喹啉生物碱对hIAPP聚集的抑制作用

使用ThT测定来研究在不存在或存在不同摩尔比的生物碱的情况下hIAPP的聚集行为。结果表明，CHE对hIAPP聚集的抑制作用比其他两种生物碱更明显。

图2 异喹啉生物碱对hIAPP聚集的抑制作用

2. hIAPP的粒径及形态变化分析

使用动态光散射（DLS）获得溶液中粒度分布的信息，结果表明，三种生物碱，尤其是CHE，能很好地分散肽聚集体，说明生物碱对hIAPP聚集有抑制作用。

原子力显微镜（AFM）进一步证实了三种异喹啉生物碱对hIAPP原纤维化的抑制作用。在310 K下孵育72 h后，单独的肽显示出独特的长、厚和无分支的原纤维结构，这一结果与ThT和DLS数据一致。

图3 hIAPP的粒径及形态变化分析

3. 预成型hIAPP原纤维的重塑

许多抑制剂可以重塑成熟的原纤维，在药物开发中具有很大的前景。在本项研究中，通过ThT动力学分析和AFM图像评估了hIAPP原纤维的重塑。结果表明，三种生物碱均能有效地重塑成熟纤维;多肽的解聚过程在9 h内基本完成，其中CHE的解聚能力相对较强; 3种生物碱的抑制作用与它们在相同摩尔比下的解聚能力相似。

图4 预成型hIAPP原纤维的重塑

4. 肽寡聚化的减少

采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测生物碱对肽寡聚化的减少结果表明，三种生物碱可以降低肽寡聚化，并且该方法能够区分球形寡聚体，并阐明CHE与其他两种寡聚体的差异。

图5A 肽寡聚化的减少

5. hIAPP诱导的细胞毒性的调节

由hIAPP聚集引起的寡聚体和原纤维可导致细胞毒性和β细胞功能障碍。（4，5-二甲基噻唑-2基）-2，5-二苯基溴化四氮唑（MTT）测定法使用大鼠胰岛素瘤（INS-1）细胞系检测生物碱对胰腺细胞的保护作用。数据表明，这三种生物碱的自毒性相对高于一些众所周知的抑制剂，如EGCG和姜黄素，这可能限制了这些生物碱在T2 DM中的应用；但在低浓度时，三种小分子化合物的上调作用均优于姜黄素，因此它们仍能有效抑制hIAPP纤维化，其与T2 DM相关的内在机制有待进一步研究。

图5B hIAPP诱导的细胞毒性的调节

6. 生物碱诱导的hIAPP构象变化

通过圆二色性（CD）光谱法测定生物碱存在下hIAPP的二级结构，结果表明，三种生物碱在一定程度上可以阻止hIAPP从原始结构向β-折叠组分的结构转变，从而抑制淀粉样原纤维的形成。当摩尔比增加时，CHE引起更大的构象变化，CD结果与ThT、AFM和ELISA分析结果基本一致，化合物引起了二级结构的变化，并抑制了hIAPP的聚集。

图6A 生物碱诱导的hIAPP构象变化

7. 异喹啉类生物碱与hIAPP的相互作用

采用尼罗红猝灭、等温滴定（ITC）和内源荧光猝灭等方法分析和证明了生物碱与hIAPP的结合行为，并推测了它们可能的相互作用机制。结果表明，三种生物碱均能与未聚集的hIAPP结合，从而稳定单体结构，减少了hIAPP表面疏水区的形成，其中CHE对hIAPP疏水性的影响最大。

图6B 异喹啉类生物碱与hIAPP的相互作用

在310K下进行的ITC实验表明，所有滴定中的ΔG值均为负值，这意味着生物碱与hIAPP的结合是自发的。此外，在该温度下，所有生物碱的反应都是吸热的，ΔH为正值。

图7 BBR、JAT和CHE滴定的50 μM hIAPP的ITC温度图

对于这三种生物碱，ΔH和ΔS均大于零，表明hIAPP与这三种化合物的结合以疏水相互作用为主。此外，解离常数和结合位点数N也显示在表1中。N值表明小分子和肽之间存在非特异性结合相互作用，如在其他抑制Aβ和hIAPP聚集的抑制剂中所发现的。

表1 ITC实验中310 K下hIAPP结合化合物的热力学参数

用于ELISA实验的277 K. A-11抗体（KMD Bioscience）来源于卡梅德生物，是该研究中关键的实验材料。有关多肽的研究课题热度不断，卡梅德生物可以提供多种多肽服务，包括但不限于多肽文库筛选服务、多肽合成、定制肽库等，满足客户不同的实验需求。

引用：[1] https://doi.org/10.1021/acschemneuro.2c00206.