磁珠‑SELEX 技术原理、筛选难点与适配体开发应用

一、引言

适配体是通过SELEX技术体外筛选获得的单链核酸分子，能够折叠形成高级空间结构特异性识别靶标。传统SELEX多采用滤膜、层析介质完成结合与未结合核酸的分离，操作繁琐、分离效率有限。磁珠SELEX将靶标共价或非共价固定在磁珠表面，依靠磁力快速完成固液分离，降低实验操作难度，是现阶段适配体筛选使用最广泛的固相SELEX模式^[1]。

在磁珠SELEX实验中，磁珠既是靶标的固相载体，也是分离介质。但磁珠本身会产生非特异性吸附，文库中部分核酸序列会直接结合裸磁珠，形成假阳性适配体，干扰SELEX富集结果，因此反筛步骤必不可少。

二、磁珠SELEX 的技术原理与实验流程

磁珠SELEX核心是将靶蛋白、小分子等靶标偶联在功能化磁珠表面，将随机 ssDNA/ssRNA 文库与靶标磁珠复合物孵育，文库中部分适配体序列结合靶标，未结合的核酸分子通过磁力洗涤去除；洗脱得到结合的核酸，经PCR扩增生成下一轮筛选文库，重复多轮SELEX循环，逐步富集高特异性适配体序列^[2]。

完整实验流程分为五个环节：

1.靶标固定：选用羧基、氨基等活化磁珠，通过共价偶联将靶标固定至磁珠表面，同时制备未偶联靶标的裸磁珠用于反筛；

2. 反筛去除背景：核酸文库先与裸磁珠孵育，去除直接吸附磁珠基质的非特异序列，降低SELEX后期假阳性；

3. 正筛富集：将经过反筛的文库与靶标磁珠混合孵育，磁力架分离，多次洗涤去除未结合核酸；

4. 洗脱与扩增：热洗脱或者竞争洗脱回收结合在靶标上的核酸，PCR 扩增得到新的单链文库，进入下一轮循环；

5. 测序：SELEX结束后对富集文库开展NGS高通量测序。

三、磁珠SELEX的技术优势与现存难点

1.磁珠SELEX技术优势

第一，磁珠分离操作简便，不需要复杂过滤、层析设备，磁力架即可快速完成固液分离，缩短每一轮SELEX的实验周期。第二，靶标消耗量低，少量靶标偶联在磁珠表面即可开展筛选，适合珍贵蛋白、小分子靶标的适配体开发[1]。第三，方案灵活，既可以固定靶标，也可固定文库，同时方便设置裸磁珠反筛，有效压制基质结合序列的富集。第四，通量灵活，可同时开展多组平行SELEX筛选，适配不同类型靶标，是绝大多数蛋白靶标适配体筛选的首选方案^[3]。

2.磁珠SELEX 主要难点

首先，靶标偶联至磁珠表面时，共价修饰可能遮蔽靶标的关键识别表位，筛选得到的适配体只能识别固定状态的靶标，对游离状态靶标结合能力差。其次，核酸会疏水、静电吸附磁珠基质，即便经过封闭，依旧会出现基质结合序列，若缺少反筛，这类序列会在SELEX后期占据文库主要比例，全部为无效适配体。第三，磁珠偶联密度影响筛选结果，靶标固定密度过高容易产生多价效应，筛选出低亲和力的适配体；固定密度过低，文库得不到有效富集。另外，磁珠批次差异、缓冲液成分改变，都会影响磁珠SELEX的重复性。

四、磁珠 - SELEX 技术主流应用场景

1.生物诊断与传感探针开发

将靶标固定于磁珠上，经多轮 SELEX 富集得到的适配体，可替代抗体应用于荧光检测、电化学传感、快速试纸等诊断平台，具备稳定性好、成本更低的特点，适宜标准化检测试剂的开发。

2.靶向药物与精准递送载体研发

磁珠SELEX 筛选获得的适配体可特异性结合靶蛋白的活性位点，实现蛋白拮抗、肿瘤靶向干预；还可修饰纳米载体、脂质体，完成药物的精准递送。

3.小分子与蛋白互作机制研究

对于微量蛋白、小分子这类难筛选靶标，磁珠SELEX 具有靶标消耗少、富集效率高的优势，可高效筛选特异性适配体，广泛应用于分子互作、结构生物学等研究。

4.食品安全与环境检测领域

利用磁珠反筛去除非特异性序列，显著降低检测假阳性，可用于食品安全、环境监测方向的快速检测产品开发。

五、天津卡梅德生物磁珠SELEX 相关技术服务

1.方案设计：评估靶标理化性质，选择适配的功能化磁珠，确定靶标偶联工艺，规划SELEX轮次、洗涤条件、裸磁珠反筛方案；

2.磁珠偶联与封闭：完成靶标与磁珠共价偶联，同时制备裸磁珠反筛对照，封闭磁珠表面非特异结合位点；

3.多轮 SELEX 筛选：每轮先做裸磁珠反筛，再开展靶标磁珠正筛，磁力分离洗涤，核酸洗脱与文库扩增，逐步提升筛选压力；

4.测序解析：对多轮文库开展 NGS 测序，分析序列富集趋势，挖掘候选适配体；

5.活性验证：合成候选适配体，采用 SPR、MST 等方法检测对游离靶标的亲和力，验证特异性；

6.样品交付：交付完整实验报告、测序原始数据、合成适配体样品，支撑诊断探针、靶向分子前期开发。

 FAQs

Q：磁珠‑SELEX 多轮筛选文库富集明显，但是候选适配体对游离靶标几乎没有结合活性，是什么主要原因？

①筛选得到的并不是真正靶标特异性适配体，而是大量结合磁珠基质的核酸序列，裸磁珠反筛不足，这类序列在SELEX过程中不断被富集。

②靶标共价偶联到磁珠表面时，修饰位点恰好位于靶标的识别表位，适配体识别的是磁珠固定状态下的特殊构象，游离状态靶标表位不存在，因此无结合。

③磁珠表面靶标密度很高，产生多价结合效应，弱结合序列在固相条件下被富集，脱离磁珠环境后亲和力完全丧失。

④部分靶标固定后发生变性，筛选针对变性蛋白的适配体，无法识别天然游离靶标。针对该现象，需要强化裸磁珠反筛，控制靶标偶联密度，同时优先使用天然游离靶标完成后续验证。

参考文献：

[1] Chinchilla-Cárdenas DJ, Cruz-Méndez JS, Petano-Duque JM, et al. Current developments of SELEX technologies and prospects in the aptamer selection with clinical applications. J Genet Eng Biotechnol. 2024;22(3):100400. doi:10.1016/j.jgeb.2024.100400

[2] Wang K, Wang M, Ma T, Li W, Zhang H. Review on the Selection of Aptamers and Application in Paper-Based Sensors. Biosensors (Basel). 2022;13(1):39. Published 2022 Dec 27. doi:10.3390/bios13010039

[3] Cai R, Chen X, Zhang Y, Wang X, Zhou N. Systematic bio-fabrication of aptamers and their applications in engineering biology. Syst Microbiol Biomanuf. 2023;3(2):223-245. doi:10.1007/s43393-022-00140-5