一、引言

核酸适配体凭借分子量小、易化学修饰、低免疫原性等优势，在分子诊断、靶向递送、药物拮抗领域得到广泛应用。核酸适配体的性能很大程度取决于靶标类型，蛋白与细胞是核酸适配体筛选中使用最多的两类靶标^[1]。针对纯化蛋白开展筛选，靶标组分明确，易于获得高亲和力核酸适配体；而细胞作为完整复杂靶标，表面包含大量膜蛋白、糖链、脂质，筛选得到的核酸适配体识别真实细胞表面构象，更适合细胞靶向相关研究。

核酸适配体结合靶标不是依靠碱基互补配对，而是通过单链核酸折叠形成茎环、凸起、G四链体等高级空间结构，与靶标表面位点发生多点相互作用^[2]。针对蛋白靶标和细胞靶标，核酸适配体的筛选条件、结合环境、干扰因素各不相同。如果不区分靶标特性，容易出现核酸适配体体外结合良好，实际样品中特异性差的现象。天津卡梅德生物搭建成熟 SELEX 筛选平台，可分别开展蛋白靶标 SELEX 筛选以及细胞靶标 CellSELEX 筛选，获得核酸适配体候选序列，结合 NGS 测序解析、亲和力验证、细胞结合验证，一站式完成核酸适配体从筛选到活性评价的全流程服务。

二、核酸适配体主要靶标分类

1. 蛋白靶标

蛋白是核酸适配体筛选最经典的靶标类型，绝大多数早期核酸适配体均以纯化蛋白作为筛选对象。蛋白靶标包含细胞因子、酶、受体胞外域、抗原、病毒结构蛋白等，筛选时一般使用纯化后的可溶性蛋白，可固定在磁珠、固相载体上开展分子SELEX筛选^[3]。

使用蛋白靶标开展筛选，靶标组成单一，筛选条件可控，能够直接获得结合蛋白特定表位的核酸适配体，便于后续解析核酸适配体与蛋白的结合位点。但蛋白靶标也存在短板：体外纯化的蛋白可能丢失天然构象，翻译后修饰缺失，导致筛选得到的核酸适配体无法识别细胞表面天然状态的同源蛋白。在实际项目中，蛋白靶标筛选常作为初筛手段，后续再使用细胞开展特异性验证。

2.细胞靶标

细胞靶标以完整活细胞作为筛选对象，采用 CellSELEX 技术，不需要提前纯化膜蛋白，直接以完整细胞表面全部生物分子作为靶标池开展筛选^[4]。细胞靶标可以是肿瘤细胞、病原体感染细胞、免疫细胞等，同时设置阴性细胞进行反筛，去除非特异性结合的核酸适配体序列。

以细胞作为靶标筛选的核酸适配体识别细胞表面天然构象的膜蛋白或糖复合物，更贴近体内真实生理环境，适合开发细胞靶向探针与靶向递送工具。但细胞靶标组分高度复杂，细胞表面有成百上千种蛋白分子，筛选得到的核酸适配体对应的靶标蛋白往往未知，后续需要开展靶标鉴定工作；同时细胞状态、活细胞活性会直接影响核酸适配体筛选结果，实验重复性控制难度高于纯化蛋白靶标筛选。

三、核酸适配体分子结合机制

1.核酸适配体-蛋白结合机制

核酸适配体结合蛋白的核心是核酸折叠形成特定三维空间构象，通过多种非共价相互作用识别蛋白表面表位，主要作用力包含氢键、静电相互作用、疏水与 ππ 堆积、范德华力，诱导契合效应发挥关键作用。在未结合靶标时，部分核酸适配体处于无序状态，接触蛋白靶标后发生构象重排，形成稳定复合物。

静电作用通常提供初始接触，带负电的核酸骨架与蛋白表面带正电氨基酸区域发生吸引；氢键与 ππ 堆积决定识别特异性，核酸的碱基、核糖基团与蛋白氨基酸侧链形成多点接触；范德华力进一步稳定复合物结构。核酸适配体识别蛋白的表位可以是沟槽、凸起结构，结合后可阻断蛋白与天然配体的相互作用，实现拮抗功能。针对蛋白靶标筛选得到的核酸适配体，其结合能力高度依赖缓冲液离子、pH，离子条件改变会直接破坏核酸适配体蛋白复合物。

2.核酸适配体-细胞结合机制

核酸适配体与细胞的结合，本质上是核酸适配体与细胞表面靶标蛋白、糖基等分子的相互作用集合，不是与完整细胞发生整体结合。核酸适配体首先扩散至细胞膜表面，识别膜上特定蛋白的胞外表位，依靠上述非共价作用力实现锚定。

细胞环境中存在大量干扰分子，血清蛋白、膜上其他分子会竞争结合核酸适配体，因此 CellSELEX 筛选需要设置严格反筛，去除结合普通细胞的非特异序列。部分核酸适配体结合靶标蛋白后，还会跟随靶标发生内吞进入细胞内部。相较于纯化蛋白体系，细胞体系环境复杂，很多在纯化蛋白条件下亲和力优异的核酸适配体，在完整细胞体系中结合活性显著下降。

四、两类靶标筛选的主要难点与组合筛选策略

蛋白靶标筛选难点集中在蛋白构象保持，若纯化蛋白变性，会筛选出识别变性蛋白的无效核酸适配体；细胞靶标筛选难点在于细胞状态波动、非特异序列富集、靶标未知。

行业经常采用组合筛选策略：先利用纯化蛋白开展分子 SELEX 缩小候选文库，再使用细胞进行 CellSELEX 与反筛，既发挥蛋白靶标筛选条件可控的优势，又保证核酸适配体可以识别细胞天然状态靶标。筛选完成后，必须开展 SPR、流式细胞等验证，分别确认核酸适配体对蛋白的亲和力以及对细胞的结合特异性。

五、天津卡梅德生物核酸适配体筛选相关技术服务

1. 方案评估：根据项目需求，确定靶标类型，选择蛋白分子 SELEX 或者细胞CellSELEX，设计反筛策略，确定文库类型与筛选轮次；

2.SELEX 筛选：蛋白靶标可采用磁珠固相等方式开展多轮富集；细胞靶标使用活细胞完成正筛与阴性细胞差减反筛，去除非特异性核酸适配体序列；

3. 测序解析：每轮文库进行 NGS 高通量测序，分析序列富集趋势，挖掘候选核酸适配体；

4. 活性验证：合成候选核酸适配体，SPR 检测对蛋白的亲和力，流式细胞术验证对细胞结合特异性；

5. 下游拓展：可提供核酸适配体截短优化、化学修饰，交付完整实验报告、测序数据、核酸样品，支撑诊断探针、靶向分子前期开发。

参考文献：

[1] Domsicova M, Korcekova J, Poturnayova A, Breier A. New Insights into Aptamers: An Alternative to Antibodies in the Detection of Molecular Biomarkers. Int J Mol Sci. 2024;25(13):6833. Published 2024 Jun 21. doi:10.3390/ijms25136833

[2] Santarpia G, Carnes E. Therapeutic Applications of Aptamers. Int J Mol Sci. 2024;25(12):6742. Published 2024 Jun 19. doi:10.3390/ijms25126742

[3] Ji, C., Wei, J., Zhang, L., Hou, X., Tan, J., Yuan, Q., & Tan, W. (2023). Aptamer-Protein Interactions: From Regulation to Biomolecular Detection. Chemical reviews.

[4] Lyu Y, Chen G, Shangguan D, et al. Generating Cell Targeting Aptamers for Nanotheranostics Using Cell-SELEX. Theranostics. 2016;6(9):1440-1452. Published 2016 Jun 15. doi:10.7150/thno.15666

FAQs

Q：核酸适配体在纯化蛋白检测时结合效果很好，但是流式检测细胞几乎没有结合，主要是什么原因？

①筛选所用的纯化蛋白为体外重组表达，缺少翻译后修饰或者空间构象和细胞表面天然蛋白不一致，核酸适配体识别的是变性或非天然构象的蛋白，无法识别细胞上天然靶标。

②细胞表面靶标蛋白丰度较低，而纯化体系中蛋白浓度高，高浓度下表现出结合，低丰度细胞表面达不到有效结合条件。

③细胞表面其他膜分子、糖链产生空间位阻，遮挡靶标蛋白的识别表位，阻碍核酸适配体靠近结合位点。

④缓冲环境差异，细胞筛选体系中的血清蛋白会竞争性吸附部分核酸适配体，降低有效浓度。

遇到该情况，建议补充 CellSELEX 细胞反筛步骤，优先筛选识别细胞天然构象靶标的核酸适配体，再开展蛋白水平亲和力验证。