流式抗体配色方案：CD系列五大经典靶标

流式细胞术作为单细胞多参数分析的利器，已广泛应用于免疫学、肿瘤学、血液学等众多研究领域。而流式实验成功的关键之一，在于抗体靶标的精准选择与荧光染料的合理搭配。CD系列分子作为细胞表面标志物的核心成员，贯穿于免疫分型、细胞活化评估、肿瘤微环境分析等各类流式应用场景。

今天，我们就从分子生物学功能和流式应用场景两个维度，系统解读CD3、CD28、CD31、CD45、CD326五大靶标，并为您提供实用的配色思路。

一、CD3——T细胞的身份标识

1、分子概述

CD3是T细胞受体（TCR）复合物的关键组成部分。TCR本身缺乏显著的胞内结构域，而是通过与CD3分子结合来传递信号[1]。CD3由CD3εγ、CD3εδ和CD3ζζ二聚体组成，这些CD3分子含有胞内信号结构域，能够将抗原识别信号偶联至下游信号转导机制。TCR-CD3复合物是一个多链结构，负责T细胞中的抗原识别^[2]。

图1：TCR-CD3复合物结构及信号通路示意图^[3]

2、流式应用场景

Ø 作为泛T细胞的经典标志物，表达于所有T细胞及NKT细胞

Ø 免疫分型中识别T细胞群体的核心靶标

Ø 与CD4/CD8联合使用可进一步区分T细胞亚群

二、CD28——T细胞协同刺激受体

1、分子概述

CD28是T细胞表面的一种跨膜共刺激糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员，为T细胞活化提供关键的共刺激信号。T细胞的完全激活需要两个信号：一是TCR/CD3介导的主信号，二是CD28介导的共刺激信号[4]。CD28结合其配体CD80（B7-1）或CD86（B7-2），转导最为重要的共刺激信号^[4]。

CD28被广泛认为是初始T细胞激活的主要共刺激通路，CD28/B7通路在抗病原体免疫应答、自身免疫性疾病和移植物排斥中发挥核心作用^[5]。

图2：T细胞-APC免疫突触分子示意图^[6]

2、流式应用场景

Ø 评估T细胞的活化状态和功能

Ø 与CD3联合检测，全面分析T细胞激活的双信号通路

Ø 研究免疫检查点与共刺激信号的交互调控

三、CD31（PECAM-1）——内皮细胞与血小板标志物

1、分子概述

CD31又称血小板内皮细胞黏附分子-1（PECAM-1），是免疫球蛋白超家族成员。它表达于血管区室内的所有细胞——内皮细胞（主要集中于细胞间连接处）、大多数白细胞亚型以及血小板上^[7]。

CD31不仅具有黏附特性，还是一个高效的信号分子，在血管生物学中发挥多重功能，包括血管生成、血小板功能、血栓形成、内皮细胞对流体剪切应力的机械感知，以及白细胞跨静脉壁迁移的多个阶段调控^[7]。

图3：PECAM-1/CD31蛋白结构域示意图^[8]

2、流式应用场景

Ø 内皮细胞鉴定和血管生成研究

Ø 血小板功能分析

Ø 肿瘤微环境中血管密度评估

Ø 部分T/B细胞亚群及髓系细胞分析

四、CD45——白细胞共同抗原

1、分子概述

CD45，即白细胞共同抗原，是造血细胞中占主导地位的酪氨酸磷酸酶[9]。它表达于所有有核造血细胞（除红细胞和血小板外）的表面。CD45通过去磷酸化作用调控多种信号分子，在T细胞受体相关激酶和传递细胞因子受体信号的调控中均发挥重要作用。

CD45的胞外结构域因选择性剪接产生多种异构体（如CD45RA、CD45RO），使用特异性识别不同异构体的抗体（如抗CD45RA、抗CD45RO）可以区分处于不同成熟和功能阶段的细胞亚群[9]。人类CD45的多态性变异与自身免疫性疾病和感染性疾病相关联，确立了CD45作为重要免疫调节因子的地位^[10]。

图4：CD45选择性剪接与异构体示意图^[11]

2、流式应用场景

Ø CD45/SSC设门策略——流式检测中最经典的白细胞识别方法

Ø 造血细胞群体的全面免疫分型

Ø 白血病/淋巴瘤的免疫表型分析

Ø 骨髓移植后嵌合体追踪（CD45.1/CD45.2同种型标记）

五、CD326（EpCAM）——上皮细胞与肿瘤标志物

1、分子概述

CD326又称上皮细胞黏附分子（EpCAM），是一种约40 kDa的I型跨膜糖蛋白。最初作为人结肠癌的显性表面抗原被鉴定，它介导上皮特异性的细胞间黏附[12]。近年来的研究表明，EpCAM的功能远不止于黏附分子——它还参与细胞信号转导、迁移、增殖和分化^[12]。

2、流式应用场景

Ø 循环肿瘤细胞（CTC）检测——定义为CD326⁺/CD45⁻细胞

Ø 上皮源性肿瘤的诊断和预后评估[^12]

Ø 肿瘤干细胞的鉴定与分选

Ø 恶性积液中的肿瘤细胞检测^[12]

六、抗体配色原则

在了解了各靶标的功能和应用场景之后，如何将它们合理搭配进一个多色流式 panel 中？以下几个核心原则值得牢记：

1、强弱搭配原则

弱表达抗原搭配强荧光染料，强表达抗原搭配弱荧光染料。荧光素亮度参考：PE、APC属高亮度；FITC、PerCP-Cy5.5属中等或偏低亮度。

2、荧光干扰规避

弱表达抗原应放在无干扰通道，强表达抗原可放在可能产生溢漏的通道。例如，CD45在所有白细胞中表达量极高，可搭配Violet系列荧光素，避免对488 nm或633 nm关键通道产生干扰。

3、抗原表达关系考量

互斥表达的抗原（如CD3和CD19）允许一定程度的荧光溢漏；共表达的抗原（如CD3和CD28）则应选择光谱重叠小的荧光组合。

4、仪器配置匹配

配色前务必了解流式细胞仪的激光器和滤光片配置，确保所选荧光素均能被仪器正常激发和检测。

 卡梅德生物致力于为科研机构提供高质量的靶点相关产品。公司提供CD28抗体、EpCAM/CD326抗体等高质量靶点产品，同时拥有标记FITC、HRP等的单克隆抗体，用于流式细胞术。公司的抗体功能性验证服务涵盖流式细胞分析（FC），确保抗体在相关应用中的有效性、稳定性和生物活性。

FAQs

Q1:为什么CD3可以作为T细胞的身份标识？它与其他T细胞标志物有什么区别？

CD3是T细胞受体（TCR）复合物的关键组成部分，由CD3εγ、CD3εδ和CD3ζζ二聚体组成。TCR本身缺乏显著的胞内结构域，必须通过与CD3分子结合来传递信号。由于CD3表达于所有T细胞及NKT细胞，而不表达于B细胞或NK细胞（NKT除外），因此被广泛用作泛T细胞的经典标志物。相比之下，CD4和CD8分别标记T细胞的辅助性亚群和细胞毒性亚群，而CD3则是识别整个T细胞群体的“总开关”——免疫分型中通常先用CD3圈定T细胞，再进一步用CD4/CD8进行亚群细分。

Q2:T细胞激活为什么需要CD28？单独CD3信号不够吗？

不够。T细胞的完全激活需要两个信号：一是TCR/CD3介导的主信号（抗原识别信号），二是CD28介导的共刺激信号。CD28结合其配体CD80（B7-1）或CD86（B7-2），转导最为重要的共刺激信号。如果只有CD3信号而没有CD28共刺激，T细胞会进入失能（anergy）状态，无法有效增殖和发挥效应功能。因此，在流式实验中CD3和CD28常联合检测，用于全面评估T细胞的激活状态。

Q3:CD45/SSC设门策略是什么意思？为什么它这么经典？

CD45是所有有核造血细胞（除红细胞和血小板外）的表面标志物。SSC（侧向散射角）反映细胞的颗粒度和复杂度。将CD45的荧光强度（纵轴）与SSC（横轴）结合做二维散点图，可以清晰地将外周血中的淋巴细胞（CD45⁺/SSCˡᵒ）、单核细胞（CD45⁺/SSCᵐᵉᵈ）、粒细胞（CD45⁺/SSCʰⁱ）等群体分群开来。这个方法之所以经典，是因为它简单、快速、无需复杂的抗体组合，就能有效排除碎片和红细胞干扰，精准识别白细胞群体，是临床流式免疫分型中最常用的设门起点。

Q4:CD31和CD326在流式应用上有什么本质区别？分别适用于什么研究方向？

两者的本质区别在于表达谱和生物学功能完全不同。

CD31（PECAM-1） 表达于血管区室内的所有细胞——内皮细胞（主要集中于细胞间连接处）、大多数白细胞亚型以及血小板上。它主要适用于：内皮细胞鉴定和血管生成研究、血小板功能分析、肿瘤微环境中血管密度评估等。

CD326（EpCAM） 则特异表达于上皮细胞及上皮源性肿瘤。它主要适用于：循环肿瘤细胞（CTC）检测（定义为CD326⁺/CD45⁻细胞）、上皮源性肿瘤的诊断和预后评估、恶性积液中的肿瘤细胞检测等。

简言之：CD31看血管和内皮，CD326看上皮和肿瘤

Q5:多色流式配色中，“强弱搭配原则”具体怎么操作？能不能举个例子？

强弱搭配原则的核心是：弱表达抗原搭配强荧光染料，强表达抗原搭配弱荧光染料。原因在于弱表达抗原产生的信号本来就少，必须用高亮度的荧光素（如PE、APC）才能将其与背景噪音区分开；而强表达抗原信号充足，用中等或偏低亮度的荧光素（如FITC、PerCP-Cy5.5）即可检测，同时还能把高亮度荧光素“让”给更需要的弱表达靶标。

举例： 在一个包含CD3和CD45的panel中，CD45在所有白细胞中表达量极高，而某个待测靶标表达较弱。此时应将PE或APC等高亮度荧光素分配给弱表达靶标，将FITC或V450分配给CD45，这样既保证了弱靶标的检出率，又避免了强抗原占用宝贵的高亮度通道。

[1]Kuhns MS, Davis MM, Garcia KC. Deconstructing the form and function of the TCR/CD3 complex. Immunity. 2006 Feb;24(2):133-9. doi: 10.1016/j.immuni.2006.01.006. PMID: 16473826.

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