哺乳动物细胞蛋白表达流程

2025-02-25

用于重组蛋白生产的表达系统主要包括原核表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。与其它表达系统相比，哺乳动物细胞能够完成糖基化修饰和蛋白的正确折叠等复杂的翻译后修饰功能，使得其表达的目的产物与天然分子更为接近，其已经成为重要的重组蛋白表达宿主。

一般来说哺乳表达适用的蛋白类型有分泌蛋白、抗体、跨膜蛋白胞外段、病毒糖蛋白胞外段。最常见的哺乳动物表达系统是中国仓鼠卵巢（CHO）细胞和人类胚胎肾脏（HEK293）细胞。

哺乳动物细胞蛋白表达流程

质粒抽提	a. 用四区划线分离法将少量菌种液涂布到Amp或Kana抗性的LB平板上； b. 恒温培养箱培养； c. 挑取单克隆，接入含有Kana或Amp抗性的LB液体培养基中； d. 摇床培养箱培养； e. 使用质粒大提试剂盒进行质粒大提（详情参照试剂盒说明书）； f. 得到收集质粒DNA；
细胞转染	a. 转染前24h，使用新鲜完全培养基，接种细胞； b. 转染当天，悬浮培养瓶中的细胞密度应在1×10^6cells/ml，台盼蓝染色计数活细胞率应大于95%； c. 在无菌离心管中加入适量完全培养基和质粒，涡旋混匀； d. 将转染试剂加入质粒混合液中涡旋混匀，室温孵育； e. 将孵育好的转染复合物滴加至悬浮培养瓶； f. 在二氧化碳培养箱中，以适宜的温度、湿度、CO₂浓度进行培养，将悬浮细胞培养瓶置于摇床，以一定的转速悬浮培养； g. 转染后4-5d，离心收集表达细胞和上清，用于蛋白纯化；
蛋白纯化	a. 装柱； b. 平衡柱子：用平衡缓冲液，以一定的流速平衡柱子，直至纯化体系基线平衡； c. 上样：基线平稳后，将配置好的纯化样品、以一定的流速过柱。样品进完后，再用平衡缓冲液洗出未结合组分，直至纯化体系基线平稳； d. 洗脱：将所有洗脱峰分开收集至无菌离心管中； e. 透析：在常规缓冲液中透析过夜；
鉴定分析	SDS-PAGE、WB