一．单克隆抗体的发现

1960年代，Rodney Porter和Gerald Edelman通过酶切和测序，成功揭示了抗体的Y型化学结构与氨基酸序列，并因此获得1972年诺贝尔生理学或医学奖。

单克隆抗体是指由单B细胞产生的高度均一的抗体，其针对一个特定抗原表位。其制备通常采用杂交瘤技术。利用单个杂交瘤细胞进行克隆扩增，可获得大量遗传性状一致、分泌相同抗体的细胞群，由此制备出的抗体即为单克隆抗体。小鼠来源的杂交瘤是首个获得稳定单克隆抗体的有效途径，由此产生的单抗已被广泛应用于多种体内治疗。

图1：全长抗体的示意图（引用[1]）

二．噬菌体展示

1. 噬菌体的分类

噬菌体的根本身份由其携带的核酸（RNA或DNA）决定，二者不会共存于同一个体中。根据这一标准，可分为以下四种类型：

✮dsDNA：双链DNA。这是最常见的一类，占已知噬菌体的95%以上，代表性例子有 T2、 T4、λ 等。

✮ssDNA：单链DNA，代表为 ΦX174。

✮dsRNA：双链RNA，代表为 Φ6（假单胞菌噬菌体）。

✮ssRNA：单链RNA，代表为 MS2、 Qβ 等。

M13噬菌体属于丝状噬菌体，其遗传物质为环状的ssDNA,ssDNA可以编码出不同的蛋白质，其中包括噬菌体外壳蛋白和噬菌体包装过程的蛋白。近年来应用的展示技术中，主要是将外源基因插入到外壳蛋白G3P基因的末端，进而在噬菌体表面展示。

图2：M13噬菌体展示示意图（引用[2]）

2. 噬菌体展示的优势

噬菌体展示技术相比传统的杂交瘤方法，有多方面的优点。

表1：噬菌体展示与杂交瘤技术对比

3. 噬菌体展示及筛选-片段抗体

（1）免疫原的制备：我们需要制备出免疫原性好的靶标分子作为免疫原，免疫原的质量是得到优质抗体的关键。

（2）动物免疫：选择身体状态良好，免疫背景清楚的动物进行免疫，免疫前需采取血清作为阴性对照，免疫方式为背部分散多点免疫，每两周进行一次。

（3）PBMC分离：将免疫后的动物血清进行效价检测，检测合格后会抽取全血，用淋巴细胞分离液进行PBMC的分离。

（4）RNA提取及cDNA文库制备：用无酶RNA提取试剂盒提取PBMC中的RNA，反转录成cDNA,再经两轮巢式PCR扩增得到单链抗体的VH和VL区域。

（5）噬菌体文库构建：单链抗体文库构建基于噬菌体展示技术（尤其是M13噬菌体展示技术），通过同源重组的方式将扩增的VH/VL片段与噬菌体载体相连，使得scFv抗体展示在噬菌体表面。免疫文库库容高达10^9-10^10，文库多样性>90%、插入率95%、阳性率>95%。

（6）噬菌体文库筛选：文库筛选的方式有很多，包括固相、液相、磁珠及细胞筛选，先进行负向筛选再进行正向筛选为一轮，通常3-4轮就可以得到亲和力强且针对靶标分子的scFv抗体序列。

图3：噬菌体文库筛选示意图（引用[3]）

三．单克隆抗体的表达

筛选到高亲和力的scFv序列后，补充上对应种属的重链恒定区片段就可以在体外表达全长单克隆抗体此种方法得到的单克隆抗体在保证结构的同时其高亲和力克隆数量也有保障，并且其花费的时间会更短。

卡梅德生物可以提供噬菌体展示及筛选服务，除此之外还可以提供下游的抗体表达、抗体人源化改造、抗体亲和力成熟等一站式服务，满足客户不同的实验需求，在科研道路上为客户保驾护航。

引用：

[1] Spadiut O, Capone S, Krainer F, Glieder A, Herwig C. Microbials for the production of monoclonal antibodies and antibody fragments. Trends Biotechnol. 2014 Jan;32(1):54-60.

[2] Ledsgaard L, Kilstrup M, Karatt-Vellatt A, McCafferty J, Laustsen AH. Basics of Antibody Phage Display Technology. Toxins. 2018; 10(6):236.

[3] Sawada T, Oyama R, Tanaka M, Serizawa T. Discovery of Surfactant-Like Peptides from a Phage-Displayed Peptide Library. Viruses. 2020 Dec 15;12(12):1442.

常见FAQs

Q1：构建抗体库时，应该如何选择展示外壳蛋白（pIII vs pVIII）？

A1：

pIII蛋白：位于噬菌体末端，仅有 3-5个拷贝。常用于展示抗体片段（如scFv、Fab），单价展示的特性更利于筛选高亲和力的抗体，因为它排除了多价展示带来的“亲合效应”，避免富集低亲和力克隆。

pVIII蛋白：是主要外壳蛋白，在噬菌体表面有约 2700个拷贝。一般用于展示短肽，多价展示虽能强烈放大信号，但筛选出的短肽亲和力可能较低。

Q2：构建文库应该选择免疫库还是天然库？它们各有什么特点？

A2：

免疫库：通过用抗原对动物（如小鼠、兔、羊驼）进行免疫后构建，文库中已富含针对该抗原的特异性抗体基因，筛选出的抗体通常具有较高的亲和力（可达nM甚至pM级别）。适用于有明确免疫原性的靶点，但构建周期较长。

天然库：来自未经免疫的健康供体（人或动物），理论上包含针对自然界中几乎所有抗原的抗体基因。其最大优势是能够快速筛选到全人源抗体，无需动物免疫。但筛选出高亲和力抗体的难度更大，通常需要通过亲和力成熟步骤来提升亲和力。

Q3：筛选后得到的抗体片段，如何鉴定其亲和力和特异性？

A3：

结合特异性验证：通过竞争性ELISA或Western Blot等方法，验证抗体片段是否特异性地识别靶标蛋白，包括分析其是否与靶标的结构表位或线性表位结合。

结合亲和力测定：测定解离常数（KD），评估抗体与靶标结合的紧密程度。常用技术包括表面等离子体共振（SPR）、生物膜层干涉技术（BLI） 或其他定量方法。

基因测序确认：测序确认抗体序列的正确性和框架完整性。

Q4：如何提高淘洗过程中高亲和力克隆的富集效率？

A4：

使用高效辅助噬菌体：普通辅助噬菌体（如M13KO7）会产生大量未展示抗体片段的“空”噬菌体。使用Hyperphage等辅助噬菌体可确保几乎所有噬菌体颗粒表面均展示抗体片段，有效展示比例可从30%-50%提升至 90%以上。

进行单价展示：采用pIII展示系统和较低的辅助噬菌体感染条件，实现单价展示，消除“亲合效应”，从而筛选出真正的、高亲和力的抗体克隆。

严格洗涤：在淘洗过程中，通过增加洗涤次数、提高去垢剂浓度（如0.5% Tween-20）或延长洗涤时间，来去除弱结合的噬菌体。

Q5：筛选到的抗体片段，如何通过亲和力成熟进一步提升其亲和力？

A5：

对初步筛选到的抗体基因进行突变、随机化或链改组，构建次级文库（Secondary Library）并再次进行更加严格的淘洗。例如在抗体的互补决定区（CDR）中引入随机突变，或利用天然存在的抗体基因进行链改组，然后通过多轮筛选，可以获得亲和力提升5倍甚至更高的突变体。