肽库筛选尤其是噬菌体展示技术，自1985年被Smith发现至今，已作为多肽药物发现的金标准^[1]。但做过肽库筛选的人都知道，这套流程看起来清晰：投入、结合、洗脱、扩增、测序，但做起来却处处是“玄学”，非特异性结合是悬在每个实验者头上的达摩克利斯之剑。

噬菌体展示最显著的缺陷，就是那些展示的肽段对靶点毫无结合亲和力的噬菌体非特异性富集和筛选出来。这篇文章我会介绍肽库筛选中大家常踩中的关于非特异性结合的坑，并结合多肽服务的实战经验帮大家总结避雷指南。

图1：噬菌体展示淘选全流程示意图^[1]

一、靶点蛋白纯度不够

1、现象：

在肽库筛选的第一轮淘选后洗脱的噬菌体滴度看起来不错，第二轮扩增也顺利，但第三轮之后送测序，回来的序列五花八门，重复率极低，更谈不上共有基序。反复验证后发现，这些序列对靶点蛋白根本没有亲和力。

图2：文库扩增前后的序列丰度变化图^[2]

2、根源

根本原因是靶点蛋白纯度不足。噬菌体文库的筛选遵循着谁多谁占优的原则，如果你的靶点蛋白中混杂了杂蛋白（例如仅5%的污染物），噬菌体文库中那些恰好结合杂蛋白的克隆会在淘选过程中被不成比例地富集，从而导致序列对靶点蛋白无亲和力的结果。

3、我们的解决方案

Ø 靶点质控前置：目的蛋白进行SDS-PAGE电泳，要求蛋白纯度>95%，才能进行下一步文库筛选。这是多肽筛选前最关键的一步质控。

Ø 设立无靶点对照：在每一轮淘选中，同步设置不加靶点蛋白的空白孔，进行平行淘选^[1]。

Ø 消减淘选：先让噬菌体文库经过包被了杂蛋白的孔，去除与杂蛋白非特异性结合的噬菌体，再将上清转移至包被了靶点蛋白的孔中进行正向筛选。

二、噬菌体扩增问题

1、现象：

第一轮淘选后洗脱的噬菌体做滴度测定，斑块长得密密麻麻。扩增后第二轮投入，一切正常。但第三轮之后，测序结果中出现了一个高频序列，这个序列对应的肽段合成后做ELISA，信号却极弱。

2、根源：

是噬菌体扩增阶段的竞争性抑制，扩增是噬菌体筛选过程中的必经环节，但它也是一把双刃剑，它还会导致非特异性结合的靶点富集。

图3：噬菌体展示文库驱动流程图^[3]

3、我们的解决方案

• 控制扩增轮数：不是肽库筛选的越多越好，我们通常控制在3-4轮筛选，超过4轮筛选对结合能力的提升趋于饱和，反而会压缩序列多样性并增加非特异性结合的风险^[3]。

• 控制扩增倍数：每轮扩增后不要过于追求极高的滴度，这是肽库筛选常见操作误区。达到常规投入所需的滴度即可投入下一轮，减少竞速积累的机会。

• NGS监控扩增前后的文库组成：对于扩增前的洗脱产物和扩增后的文库进行NGS测序，比较其序列分布变化。

三、测序高频不等于高亲和力

1、现象：

对NGS输出的数据进行分析，排名第一的克隆序列占比超过30%。然而，该序列经合成后的SPR亲和力测定结果显示，其KD值仅为微摩尔级别，亲和力水平有限。反而是排名没那么靠前的序列亲和力很强。

图4：NGS序列重复数与亲和力的相关性散点图^[4]

2、根源：

这就是测序频率与亲和力解耦的问题。NGS能告诉你有哪些被富集了，但不能直接告诉你哪几个结合的最紧密^[1]。

3、我们的解决方案：

• 合成验证不只看评分最高：对NGS排名前20的序列，按照富集倍数（而非绝对频率）排序，选取富集倍数高但绝对频率未必最高的序列同步合成验证——因为富集倍数反映的是序列在筛选压力下的动态富集程度。

• 引入AI学习思路：引入AI辅助筛选：可利用深度测序数据训练机器学习模型，识别弱富集区域中可能具有功能潜力的序列特征。

回顾以上三个“坑”，其根源均可追溯至同一个核心问题——肽库筛选并非一条简单的标准化流水线，而是一项需要多肽服务商具备深厚技术积累的系统工程，而是一项需要在各环节嵌入精细质控的系统工程。靶点蛋白纯度不足使筛选方向偏离，扩增过程中的竞争性偏差扭曲文库的真实组成，而NGS频率与亲和力的解耦则警示我们不能将高通量数据简单等同于功能验证结果。

选择专业的CRO服务商，是有效规避这些风险的关键路径。卡梅德生物（KMD Bioscience） 依托成熟的噬菌体展示平台，针对上述痛点构建了系统化的解决方案。此外，卡梅德生物还提供从多肽合成、活性验证到动物免疫、单抗制备的一站式闭环服务，确保候选肽从筛选到功能验证的全程可控。

卡梅德生物的噬菌体展示平台最多可构建1013个/mL的多肽或抗体克隆，可提供随机7肽库、12肽库、环7肽库等多种预制文库以及使用T7和M13噬菌体系统的定制化服务。肽库筛选的本质，是在109的多样性中寻找那根“针”，而专业的平台与精细的质控，正是让这场“大海捞针”变得高效而可靠的关键。

FAQs

1. “设立无靶点对照”听起来很简单，但具体怎么操作？结果怎么分析才能有效区分真实结合与背景？

无靶点对照的具体操作是：在平行孔中包被与实验组相同的封闭液（如BSA或脱脂牛奶），但不加入靶点蛋白，其余步骤（封闭、文库孵育、洗涤、洗脱、扩增）完全一致。关键在于NGS数据分析阶段的交叉比较——剔除在实验组和无靶点对照组中均出现的高频克隆，保留仅在实验组中显著富集的序列。

2. 文章中提到的“消减淘选”具体怎么操作？先经过杂蛋白包被孔这一步会不会把真正结合靶点的噬菌体也损失掉？

消减淘选的具体流程：将噬菌体文库先与固定化了“杂蛋白”（如纯化标签蛋白、宿主细胞裂解物等）的孔或磁珠孵育，收集未结合的噬菌体上清，再将该上清转移至包被了靶点蛋白的孔中进行正向淘选。由于第一步中去除了所有结合杂蛋白的克隆，后续正向筛选的靶点特异性会显著提升。

3. 文章说“控制在3-4轮筛选”，但如果3轮之后测序结果中阳性克隆的比例很低，要不要继续做第5轮？怎么判断什么时候该停？

判断是否需要继续增加轮次，建议从两个指标综合评估：

（1）投入/产出比变化——如果第3轮到第4轮的回收率（产出pfu/投入pfu）上升幅度显著收窄，说明富集已趋近饱和，继续增加轮次只会进一步压缩多样性；

（2）NGS监控序列多样性——如果第3轮时文库的独特序列数已明显下降且出现明确的共有基序，即可停止。

4. NGS分析中提到的富集倍数具体怎么计算？用这个指标筛选候选肽时一般设定什么阈值？

富集倍数通常以log₂(Output/Input) 计算，即某一特定序列在淘选后（Output）与淘选前（Input）文库中频率的比值。该指标反映的是该序列在淘选压力下被富集的程度，而非绝对丰度。

5. 文章说“排名第5、第8的序列亲和力反而更好”，那有没有可能排名第50甚至第500的序列亲和力更好？NGS分析时应该筛选到多少名才合理？

理论上存在这种可能，但概率随排名下降而显著降低。推荐策略是：对NGS前20–50条序列按富集倍数重新排序，选取富集倍数最高的15–30条候选序列进行合成验证，这是一个在验证成本与命中率之间取得平衡的经验阈值。对于筛选压力较大（靶点浓度逐轮降低、洗涤条件严格）的项目，高富集倍数序列与实测亲和力的相关性更强。

[1]Bakhshinejad B, Kjaer A. NGS and the design of an optimized phage display workflow for peptide discovery. Amino Acids. 2025 Dec 26;58(1):5. doi: 10.1007/s00726-025-03492-z. PMID: 41452380; PMCID: PMC12775084.

[2]Sinkjaer AW, Sloth AB, Andersen AO, Jensen M, Bakhshinejad B, Kjaer A. A comparative analysis of sequence composition in different lots of a phage display peptide library during amplification. Virol J. 2025 Feb 1;22(1):24. doi: 10.1186/s12985-024-02600-x. PMID: 39893369; PMCID: PMC11786364.

[3]Derda R, Tang SK, Li SC, Ng S, Matochko W, Jafari MR. Diversity of phage-displayed libraries of peptides during panning and amplification. Molecules. 2011 Feb 21;16(2):1776-803. doi: 10.3390/molecules16021776. PMID: 21339712; PMCID: PMC6259649.

[4]Gunaratne GS, Gallant JP, Ott KL, Broome PL, Celada S, West JL, Mixdorf JC, Aluicio-Sarduy E, Engle JW, Boros E, Meimetis L, Lang JM, Zhao SG, Hernandez R, Kosoff D, LeBeau AM. The characterization of variable new antigen receptors targeting FAP isolated from a novel immunized library. Commun Biol. 2025 Aug 13;8(1):1210. doi: 10.1038/s42003-025-08610-x. PMID: 40804296; PMCID: PMC12350670.