一、环七肽库的构建

环七肽库的建立是发现高效酶活性位点结合剂的前提，如何构建具有分子多样性、结构刚性与化学稳定的环七肽库，很大程度上决定了环七肽-酶之间能否建立起有效的识别与相互作用的关系。构建过程中，首先需选择适宜的分子构建块，其次可通过引入非天然氨基酸拓展环七肽库的化学空间，使其突破天然氨基酸的结构局限，展现出更优异的结合亲和力与特异性，为提升环七肽库的构建质量奠定基础。

分子多样性与后续筛选的可行性是库容量设计的核心要素。 七肽理论序列空间多达20^7种，科研人员需通过精细化设计方案降低序列重复度，其中应用最广泛的策略是剖析靶酶活性位点的结构特性，优先选择有望与关键残基发生特异性结合的氨基酸种类，从源头压缩序列筛选范围。此外，计算机模拟技术已深度融入库的优化设计流程，能有效提高环七肽库的整体质量并提升后续筛选工作的效率。

二、筛选平台的选择

酶活性位点的环七肽筛选需要依赖高效筛选平台，目前主流技术包括噬菌体展示、酵母展示、mRNA展示及DNA编码化合物库(DEL)。每种技术针对不同的情况有不同的适用场景，选择合适的平台能更有利于筛选成功。

噬菌体展示技术拥有库容体量充足、操作流程简便及成本调控高效等特点，已成为生物筛选领域的关键技术路径。该技术主要是将环七肽序列与噬菌体外壳蛋白进行融合表达，进而展示于噬菌体颗粒表面。将已构建的文库与固相化靶标蛋白充分混合后，经过3-5轮连续的生物淘选过程，能够筛选出高亲和力的专一性肽段，为药物研发工作提供高质量的候选分子。

图1 噬菌体展示库筛选流程图（源于[1]）

与噬菌体展示技术相比，酵母展示技术的突出优势在于能够提供真核生物特有的翻译后加工修饰功能，更适合需要二硫键形成或糖基化的环肽筛选。相关研究成果显示，通过在酵母细胞内共表达细菌来源的转谷氨酰胺酶，可直接在酵母细胞表面完成肽段的酶促环化反应，有效简化了环肽文库的制备流程。

图2 酵母展示大环肽（MP）系统示意图（源于[2]）

mRNA展示技术是将表型与其基因型（mRNA）通过Puromycin分子共价连接，是一种强大的体外展示平台。核心流程为通过体外转录与翻译系统合成肽-mRNA融合体，构建容量高达10^14的巨型库，这个过程无需受到细胞转染效率的限制，可以有效地筛选出低亲和力配体。

DNA编码化合物库（DEL）是利用共价键将特定的DNA标签与多肽类分子进行稳定连接，可实现常规试管体系内的大规模筛选。该技术具有库容量高（可达亿级以上）和筛选周期短的优势，同时也面临细胞穿透性和体内活性验证等方面的挑战。

三、针对酶活性位点的筛选方案设计

针对酶活性位点的环七肽筛选需要特别精密的实验设计，以区分活性位点导向的结合与非特异性结合。

（1）靶点固定化方法：固定化过程需要尽可能保持酶活性位点的天然构象，避免因固定化导致活性位点遮蔽或变形。常用的固定化方法包括通过组氨酸标签固定在镍亲和树脂上、利用生物素-链霉亲和素系统固定化以及通过特异性抗体捕获。

（2）竞争性筛选策略：在筛选过程中加入已知的酶活性位点抑制剂或底物类似物，可以竞争性地阻断环七肽与活性位点的结合，从而筛选出与非活性位点区域结合的环肽。

（3）动态筛选条件：由于酶活性位点是高度动态的，在筛选过程中应尽可能模拟生理环境。这包括使用适宜的pH缓冲液、离子强度、辅助因子等。例如，许多金属酶需要特定的金属离子辅因子来维持活性位点的正确构象，在筛选过程中补充辅因子可以提高特异性环七肽筛选成功的概率。

四、功能验证

功能性活性检测是评价环七肽的生物活性的核心手段，需要建立不同的酶的活性检测方法体系。对于蛋白酶的检测可以采用荧光共振能量转移底物和显色底物来检测其催化活性的变化；而激酶的活性检测可通过使用磷酸化特异抗体或者是放射性标记法来检测调节其磷酸化的过程。此外，需要指出的是有些环七肽可以通过非竞争性或者变构的方式作用于酶。

卡梅德生物（KMD Bioscience）依托高通量噬菌体展示平台，可针对酶活性位点定制开发多样化环七肽库，并对筛选出的环七肽序列进行标准化的酶活性检测，确保交付具备优异亲和力与良好生物活性的环七肽候选分子，为药物研发工作提供有力支持。

[1] Yu N, Yang Y, Li Y, Kang W, Zhang J, Chen Y. Screening of specific binding peptide for β-lactoglobulin using phage display technology. Food Chem. 2024;452:139522.

[2] Linciano S, Mazzocato Y, Romanyuk Z, et al. Screening macrocyclic peptide libraries by yeast display allows control of selection process and affinity ranking. Nat Commun. 2025;16(1):5367.  

[3] Holec PV, Breuckman KC, Leddy O, White FM, Bryson BD, Birnbaum ME. High-throughput screening for class I peptide MHC binding via yeast surface display. Proc Natl Acad Sci U S A. 2025;122(47):e2514741122.

常见问题汇总 

Q1：构建环七肽库时引入非天然氨基酸的核心作用是什么？

A：在构建环七肽库时，引入非天然氨基酸的核心作用在于从根本上突破天然肽类的局限性，极大地拓展了环七肽作为探针分子或先导药物的“化学空间”与功能潜力。

首先，非天然氨基酸能显著增强结构多样性。其独特的侧链基团（如炔基、叠氮基、特殊芳香环等）是天然氨基酸所不具备的，这为环七肽引入了全新的化学性质和相互作用位点，可用于与靶标蛋白形成更特异、更强的疏水、π-π堆积或静电相互作用，从而筛选出天然肽库无法得到的超高亲和力配体。

其次，它能有效优化成药性。许多天然肽易被蛋白酶水解、细胞膜穿透性差。通过引入D型氨基酸、α-甲基化氨基酸或β-氨基酸等，可以改变肽骨架的构象，赋予其对抗蛋白酶降解的能力，并改善其细胞渗透性，为开发口服或系统性给药的肽类药物奠定基础。

最后，非天然氨基酸是精确调控构象的关键工具。环七肽的生物学功能强烈依赖于其特定的三维空间折叠。通过引入构象限制性氨基酸，可以将肽链锁定在某一优势构象，减少熵罚，提高与靶标结合的选择性和效力。

Q2：环七肽筛选中，噬菌体展示与酵母展示技术的核心适用差异是什么？

A：两者的核心差异源于表达体系与修饰能力。噬菌体展示技术为原核体系，优势在于库容量大（可达10^11）、操作简便且成本较低，适用于无需复杂翻译后修饰的环七肽筛选，通过多轮生物淘选即可富集特异性结合肽。

酵母展示系统具备真核细胞翻译后修饰能力，更适合需二硫键形成或糖基化的环七肽。同时，通过共表达细菌转谷氨酰胺酶可实现酵母表面酶促环化，具有位点选择性高、反应温和等特点，尤其适配含特定谷氨酰胺和赖氨酸残基的环肽构建。

Q3：针对酶活性位点的筛选，竞争性筛选策略如何实现特异性富集？

A：竞争性筛选策略的核心逻辑是利用已知配体与靶标活性位点的特异性结合，区分环七肽的结合模式。筛选过程中加入已知的酶活性位点抑制剂或底物类似物，这些分子会优先与酶活性位点结合，形成竞争性阻断。

在筛选过程中，仅能与酶非活性位点结合的环七肽会被保留，而靶向活性位点的环七肽因无法结合而被去除。通过后续反向筛选或洗脱步骤，可剔除非特异性结合肽，从而特异性富集能与酶活性位点精准结合的环七肽，提升筛选效率与结果可靠性。

Q4：DNA编码化合物库（DEL）技术筛选环七肽时，核心挑战是什么？如何应对？

A：DEL技术的核心挑战集中在细胞穿透性与体内活性验证两方面。DEL筛选通常在体外试管中进行，筛选出的环七肽可能因结构特性难以穿透细胞膜，无法与胞内酶作用；同时，体外结合活性与体内生理环境下的活性存在差异，需额外验证。

应对策略包括筛选时引入具有细胞穿透性的结构单元，或后续对环七肽进行化学修饰优化穿透能力；建立“体外筛选-细胞水平验证-动物模型评估”的阶梯式验证体系，通过细胞活性实验初步筛选，再利用动物模型确认其体内靶向性与生物活性，弥补体外筛选的局限性。

Q5：酶活性位点固定化时，常用方法有哪些？操作中需遵循什么核心原则？

A：对于酶活性位点固化，常用方法主要有三类：

（1）利用组氨酸标签将酶固定在镍亲和树脂上，依赖金属配位作用实现特异性结合；

（2）通过生物素-链霉亲和素系统，借助两者极强的亲和力完成固定，稳定性高；

（3）利用特异性抗体捕获酶，适配无标签酶的固定需求。

在操作中要尽可能保持酶活性位点的天然构象，避免固定化导致活性位点遮蔽或变形。需控制固定化条件（如缓冲液pH、温度），避免强反应条件破坏酶的空间结构。同时，优化固定化密度，防止酶分子过度聚集影响活性位点暴露，确保筛选出的环七肽能与天然活性位点有效结合。