双特异性适配体的筛选构建、技术难点与研发应用

一、介绍

适配体是经SELEX体外筛选得到的单链核酸分子，依靠折叠形成独特三维结构识别靶标。普通单靶点适配体仅识别单一分子，难以满足多靶点协同干预需求，而双特异性适配体拥有两套独立识别结构，可同时结合两种不同靶标，既可以结合同一细胞表面两个不同受体，也可分别结合两个不同细胞表面分子，实现分子桥接效应^[1]。

双特异性适配体的开发分为两大路线：一是先分别通过SELEX获得两个独立单靶点适配体，借助linker进行模块化拼接；二是采用ToggleSELEX交替切换两种靶标直接筛选天然双特异性适配体。双特异性适配体保留核酸分子分子量小、易化学修饰、低免疫原性等特点，但拼接后容易出现构象干扰、亲和力下降等问题。天津卡梅德生物依托成熟的SELEX技术体系，可完成单靶点适配体筛选、双特异性适配体分子构建、多维度活性验证，一站式支撑双特异性适配体前期研发。

二、技术原理与实验流程

双特异性适配体核心原理：将两套识别不同靶标的适配体功能单元，通过核酸连接子（linker）进行组装，两个功能单元各自折叠形成独立三维结构，分别结合对应的靶标，实现双靶点同时识别；ToggleSELEX模式下，文库交替暴露于两种靶标，筛选可同时结合两个靶标的核酸序列，获得原生双特异性适配体^[2,3]。

主流实验流程分为模块化拼接路线与 ToggleSELEX 筛选路线：

路线一：模块化拼接（最常用）

①单靶点筛选：针对靶标 A、靶标 B 分别开展磁珠SELEX、CellSELEX或 CESELEX，获得针对两个靶标的高活性适配体；

②分子构建：设计不同长度与柔性的核酸 linker，将两段适配体序列串联拼接，构建多种双特异性适配体候选分子；

③构象与结合验证：验证拼接后适配体是否依然同时保留对两个靶标的结合能力，排除 linker 带来的空间位阻；

④优化筛选：对 linker 长度、序列进行截短优化，筛选性能最优的双特异性适配体；

⑤功能评价：开展 SPR、流式、细胞功能实验，评估双特异性适配体的生物学活性。

路线二：ToggleSELEX 直接筛选

①随机核酸文库交替与靶标 A、靶标 B 孵育，每轮SELEX交替切换靶标；

②每轮完成结合分离洗脱扩增循环，逐步富集可以同时识别两种靶标的序列；

③NGS 测序挖掘候选，验证候选分子是否具备真正双靶标结合能力。

ToggleSELEX难度高、富集效率偏低，现阶段绝大多数双特异性适配体采用模块化拼接方式完成构建。

三、技术优势与现存难点

1.技术优势

①双特异性适配体可实现双靶点协同识别，介导细胞细胞桥接，招募免疫细胞靶向肿瘤细胞，实现免疫重定向，是肿瘤免疫研究的重要工具分子^[4]。

②基于成熟SELEX得到的单靶点适配体进行拼接，开发周期可控，分子易于化学修饰改造。

③相较于双特异性抗体，双特异性适配体分子量更小，合成成本低，批次稳定性好。

④可同时阻断两条信号通路，用于多靶点分子检测，提升检测体系特异性。

2.主要难点

①两段适配体拼接后，linker 会带来空间位阻，两段适配体单元互相干扰折叠，造成其中一端甚至两端结合亲和力显著下降，这是双特异性适配体构建最常见问题。

②ToggleSELEX直接筛选难度大，文库中可同时结合两个靶标的天然序列占比极低，SELEX富集效率差。

③体内环境核酸酶降解、肾脏清除，导致双特异性适配体体内半衰期短，需要额外化学修饰。

④双靶点活性验证体系复杂，需要分别验证对两个靶标的结合，不能仅做单一靶标验证。

四、技术主流应用场景

1.肿瘤免疫桥接分子研发

双特异性适配体一端识别肿瘤细胞表面抗原，另一端结合免疫细胞表面受体，介导肿瘤细胞与 T 细胞、NK 细胞形成人工免疫突触，激活肿瘤杀伤效应，是肿瘤免疫临床前研究的热门方向。该类双特异性适配体大多基于SELEX获得的细胞靶向适配体拼接构建^[1]。

2.多靶点生物传感与体外诊断

将双特异性适配体作为识别元件，同时识别样本中两个标志物，双重识别模式显著降低假阳性，适用于肿瘤标志物、炎症因子联合检测，用于构建荧光、电化学生物传感器。

3.靶向药物递送与蛋白降解

双特异性适配体一端识别致病靶蛋白，另一端结合溶酶体受体，介导靶蛋白向溶酶体转运实现蛋白降解；也可一端靶向病灶，另一端结合药物载体，实现药物精准递送，拓展核酸靶向工具的应用边界。

4.分子互作与基础生化研究

双特异性适配体可作为分子交联工具，介导两种蛋白的相互靠近，用于研究蛋白蛋白相互作用，解析细胞信号通路，为基础分子生物学提供新型工具分子。

五、天津卡梅德生物相关技术服务

1. 方案设计：评估两个靶标特性，确定筛选路线，选择模块化拼接或 ToggleSELEX方案，设计 linker 梯度方案；

2. 单靶点适配体筛选：根据靶标类型选用磁珠SELEX、CellSELEX、CESELEX，完成单靶点适配体筛选、NGS解析、亲和力初筛；

3. 双特异性适配体构建：设计多组不同 linker，合成多版本双特异性适配体候选分子，开展序列截短优化；

4. 多维度活性验证：分别验证候选分子对两个靶标的结合能力，SPR 检测蛋白亲和力，流式验证细胞水平结合，开展细胞功能评价；

5. 样品交付：交付完整实验报告、测序原始数据、合成双特异性适配体样品，支持后续化学修饰改造。

常见问题

Q：双特异性适配体验证时，其中一端靶标结合活性显著下降，主要是什么原因？

①linker长度或柔性不合适，造成空间位阻，两段适配体单元互相干扰，破坏其中一段适配体的三维折叠构象，丧失结合能力。

②原始单靶点适配体本身序列冗余，拼接后序列之间发生分子内错配，干扰功能结构形成。

③两个靶标分子空间尺寸大，双特异性适配体难以同时容纳两个大分子靶标，产生空间排斥。

④缓冲环境影响核酸折叠，拼接分子对离子条件更加敏感。解决办法：设置多组不同长度linker，对原始适配体进行截短优化，分别对两个靶标开展独立活性验证，筛选兼容性最优的双特异性适配体分子。

参考文献：

[1]Thomas BJ, Porciani D, Burke DH. Cancer immunomodulation using bispecific aptamers. Mol Ther Nucleic Acids. 2022;27:894-915. Published 2022 Jan 10. doi:10.1016/j.omtn.2022.01.008

[2]Kong HY, Byun J. Nucleic Acid aptamers: new methods for selection, stabilization, and application in biomedical science. Biomol Ther (Seoul). 2013;21(6):423-434. doi:10.4062/biomolther.2013.085

[3]Shraim AS, Abdel Majeed BA, Al-Binni MA, Hunaiti A. Therapeutic Potential of Aptamer-Protein Interactions. ACS Pharmacol Transl Sci. 2022;5(12):1211-1227. Published 2022 Nov 4. doi:10.1021/acsptsci.2c00156

[4]Guo R, Chen X, Ying L, et al. A novel bispecific aptamer targeting LAG3 and HER2 enhances T cell-mediated immunotherapy against HER2-positive cancer cells. Front Immunol. 2025;16:1557910. Published 2025 Jul 21. doi:10.3389/fimmu.2025.1557910