一、引言

单克隆抗体广泛应用于科研检测、诊断试剂与抗体药物研发，一旦杂交瘤细胞株丢失、退化，对应的抗体便无法继续制备，杂交瘤测序可以从细胞中获取抗体基因序列，实现抗体的基因水平保存与重组重建。在缺少细胞样本，仅留存纯化抗体蛋白时，可以采用N 端测序获取抗体 N 端氨基酸信息；若需要完整的轻重链包括恒定区信息，则需要开展全长测序。

N 端测序、全长测序、杂交瘤测序的样本输入、技术原理、输出结果差异明显，项目中需要根据现有样本类型选择合适方案。如果测序方案选择不当，会出现序列不全、CDR 区缺失、真假抗体转录本混淆等问题，直接造成后续重组抗体表达失败。天津卡梅德生物抗体测序平台，可开展杂交瘤测序、N 端测序以及全长测序，根据客户提供杂交瘤细胞、RNA、纯化抗体蛋白等不同样本，匹配对应测序方案，完成序列解析，向下游提供可直接用于载体构建的抗体序列。

二、抗体测序技术原理与流程

1. 杂交瘤测序

杂交瘤测序以杂交瘤细胞或者杂交瘤来源 RNA 为实验材料，是获取单克隆抗体基因序列最常用的手段。杂交瘤测序标准流程为：杂交瘤细胞复苏培养，提取总 RNA，反转录得到 cDNA；采用 5'‑RACE 或者简并引物 RT‑PCR 扩增抗体重链、轻链基因；将扩增产物克隆至载体，经过 Sanger 测序获得轻重链可变区序列，也可进一步延伸得到完整编码序列。^[1,2]

杂交瘤测序的核心难点在于杂交瘤细胞为融合细胞，细胞内会存在异常假免疫球蛋白转录本，需要通过生物信息学比对、后续重组表达验证，筛选出真正分泌目标抗体的轻重链配对。杂交瘤测序只能处理活细胞或者 RNA 样本，无法直接对纯化抗体蛋白开展测序。杂交瘤测序输出的可变区序列，可直接用于 scFv、Fab、重组 IgG 载体构建。

2. N端测序

N 端测序属于蛋白水平测序，不需要细胞或核酸样本，直接以纯化后的抗体蛋白作为样品。传统N 端测序采用 Edman 降解，现代平台更多依靠质谱技术完成N 端测序，解析重链、轻链 N 端前若干个氨基酸。N 端测序多用于确认抗体信号肽切割位点、鉴定抗体 N 端氨基酸，也可用来辅助验证杂交瘤测序得到的基因翻译后的蛋白 N 端是否与理论一致。

但N 端测序的局限性十分突出，N 端测序仅能获得蛋白 N 端局部片段，无法得到完整 CDR 区、完整可变区，不能单独依靠N 端测序完成抗体的完整重建。当客户仅剩余少量纯化抗体蛋白，没有杂交瘤细胞时，仅依靠N 端测序不足以拿到完整抗体序列，需要结合质谱 de‑novo 测序完成全长测序。^[3]

3. 全长测序

全长测序分为基因水平全长测序与蛋白 de‑novo全长测序两种模式。基因层面的全长测序，在杂交瘤测序基础上，扩增包含信号肽、可变区、恒定区的完整重链、轻链编码基因，拿到完整 IgG 全长核酸序列，适合亚型转换、Fc 改造等研究；蛋白层面的全长测序直接对纯化抗体做质谱从头测序，不需要杂交瘤细胞，直接解析抗体完整氨基酸序列，适合细胞株丢失、仅有抗体蛋白样品的场景。^[4]

全长测序的技术门槛更高，蛋白从头全长测序受样品纯度、抗体亚型影响，部分序列区域存在测序覆盖度不足风险；基因水平的全长测序依赖高质量杂交瘤 RNA，扩增难度高于单纯可变区扩增。

三、不同测序技术适用场景对比

1.杂交瘤测序：样本为杂交瘤细胞 / 杂交瘤 RNA；优势是测序准确度高，成本可控，优先获取 VH/VL 可变区；适合绝大多数单抗细胞株保种、重组抗体制备；缺点是必须要有细胞或者 RNA，不能处理抗体蛋白样品。

2.N 端测序：样本为纯化抗体蛋白；获得抗体 N 端局部氨基酸；用于 N 端确认、序列验证；N 端测序不能单独完成抗体重建，常作为辅助验证手段。

3.全长测序：基因型全长测序依托杂交瘤样本获取完整轻重链核酸；蛋白 de‑novo全长测序仅需纯化抗体蛋白，细胞丢失场景下实现抗体挽救；全长测序成本更高，蛋白版本全长测序存在一定失败风险。

四、天津卡梅德生物抗体测序相关技术服务

1.杂交瘤测序服务：接收杂交瘤细胞株、冻存细胞或 RNA 样本；细胞复苏培养、效价复核、RNA 提取、RTPCR 扩增轻重链；载体克隆测序，完成 V (D) J、CDR 区注释，区分真假转录本，交付可变区序列，可拓展做基因水平全长测序。

2.N 端测序服务：接收纯化抗体蛋白样品，质谱完成N 端测序，解析重链、轻链 N 端氨基酸，用于序列验证、信号肽切割位点确认。

3.全长测序服务：两种方案可选，基于杂交瘤样本的基因全长测序，获取包含恒定区的完整轻重链核酸序列；基于抗体蛋白的质谱 denovo全长测序，针对杂交瘤细胞丢失，仅留存抗体蛋白的样品，解析完整氨基酸序列。

4. 下游配套：序列完成后，可直接开展抗体载体构建、重组抗体表达纯化、抗体人源化改造，交付测序原始文件、序列报告、重组质粒、重组抗体成品。

FAQs

Q：杂交瘤细胞已经丢失，手上仅保存纯化后的单克隆抗体蛋白，此时可以直接做杂交瘤测序吗？该如何选择测序方案？

A：不可以直接开展杂交瘤测序。杂交瘤测序依赖杂交瘤活细胞或者细胞来源RNA，没有杂交瘤细胞就无法提取抗体mRNA，杂交瘤测序无法执行。该场景下，仅能以纯化抗体蛋白作为输入，优先选择质谱denovo全长测序，直接解析抗体完整氨基酸序列；也可以搭配N端测序作为辅助校验，核对N端氨基酸信息。拿到蛋白全长测序氨基酸序列后，可反向进行密码子优化，合成对应的抗体基因，构建表达载体，实现抗体的体外重组重建。需要注意，蛋白从头全长测序对抗体纯度要求较高，样品杂质过多会降低测序准确率。

参考文献：

[1] Meyer L, López T, Espinosa R, Arias CF, Vollmers C, et al. (2019) A simplified workflow for monoclonal antibody sequencing. PLOS ONE 14(6): e0218717. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0218717

[2] Subas Satish HP, Zeglinski K, Uren RT, et al. NAb-seq: an accurate, rapid, and cost-effective method for antibody long-read sequencing in hybridoma cell lines and single B cells. MAbs. 2022;14(1):2106621. doi:10.1080/19420862.2022.2106621

[3] de Graaf, S. C., Hoek, M., Tamara, S., & Heck, A. J. R. (2022). A perspective toward mass spectrometry-based de novo sequencing of endogenous antibodies. mAbs, 14(1). https://doi.org/10.1080/19420862.2022.2079449

[4] Resemann A, Jabs W, Wiechmann A, et al. Full validation of therapeutic antibody sequences by middle-up mass measurements and middle-down protein sequencing. MAbs. 2016;8(2):318-330. doi:10.1080/19420862.2015.1128607