一．单链抗体及文库展示

单链抗体（scFv）由1个VH域和1个VL域以及一段短肽组成，并且scFv抗体不包含Fc片段，分子量约为传统IgG抗体的六分之一。在重组抗体制备的初始阶段，通常先通过动物免疫获得针对目标抗原的抗体序列，再利用PCR技术扩增出VH和VL区域。随后，通过scFv连接肽将这两个区域连接起来，共同克隆至噬菌体载体中，达到体外展示的目的。借助靶标抗原，可从大量噬菌体中筛选出具有高亲和力的scFv序列。

卡梅德生物采用M13噬菌体展示系统，将scFv抗体基因整合至PⅢ基因内，使其与G3P外壳蛋白融合表达，从而将scFv抗体展示在M13噬菌体表面，如图1所示：

图1 M13噬菌体（引用[3]）

二．单链抗体噬菌体库筛选

单链抗体文库的筛选基于噬菌体展示技术，通过同源重组的方式将扩增的VH片段与VL片段通过scFv连接肽相连并克隆到噬菌体载体上，使得scFv抗体展示在噬菌体表面，通过固相或液相筛选的方式进行噬菌体文库的筛选。固相筛选是将靶标固定到一个载体上（ELISA板或芯片）然后结合文库中的噬菌体；磁珠筛选属于液相筛选的一种，通常将靶标蛋白结合到磁珠上再与文库进行孵育；细胞筛选既可以用固相筛选的方式也可以用液相筛选的方式进行，与其他筛选方式的区别在于筛选源变为了细胞。

图2 噬菌体文库筛选流程（引用[3]）

1. 靶标的处理：固相筛选中会将靶标固定在ELISA板或者芯片上，用细胞做固相筛选时则需提前进行铺板并使细胞密度增长到80%左右，同时要确保细胞处于单层状态。

2. 封闭：无论是液相筛选还是固相筛选在靶标与噬菌体结合前均需要将筛选源进行封闭，避免噬菌体文库的非特异性结合。

3. 噬菌体文库与靶标结合：将噬菌体文库加入到含有靶标的承载体中进行混合孵育，磁珠筛选时会增加一步与磁珠的结合。一些比较难表达的抗原蛋白可以用其过表达的病毒进行固相筛选；也可以用过表达细胞系或者天然表达次靶标的细胞系进行细胞筛选。此外筛选通常会涉及到负筛，用蛋白作为筛选源时，负筛的抗原通常为同家族其他的蛋白；细胞作为筛选源时，负筛的细胞通常为不表达靶标蛋白的同种系细胞。所以用于筛选的靶标有多种选择，针对抗原的复杂程度可以选择不一样的靶标以及筛选方式进行灵活筛选。

4. 洗涤：结合完成后若为负筛阶段则应收集不结合部分继续与正筛抗原结合，若为正筛阶段则去除不结合部分，通常用PBS缓冲液进行洗涤，将残留不结合或弱结合组分去除。

5. 洗脱：将结合在正筛抗原表面的噬菌体用酸性洗脱缓冲液进行洗脱并用中和液中和其PH值，使得噬菌体完整性不被破坏。将洗脱后的噬菌体感染TG1细胞并进行菌平板滴度鉴定。

6. 富集阳性噬菌体：将洗脱后的噬菌体全部感染TG1细胞并加入辅助噬菌体进行扩增并纯化，富集后的噬菌体文库经滴度鉴定后可用于第二轮的文库筛选实验。

7. 通常3-5轮就可以得到亲和力强且针对靶标分子的抗体序列，此噬菌体展示的序列组成了靶标分子的高特异性及亲和力的scFv抗体文库，后续此序列可以根据客户的实验需要进行抗体表达及功能学验证。

卡梅德生物致力于为客户提供多物种的scFv抗体文库筛选服务。我们将根据客户的不同需求，提供个性化的方案设计，在筛选过程中，团队会结合抗原特性与项目难度，推荐最适合的筛选策略，全力协助客户推进科研探索与药物抗体开发的进程。

参考文献

[1] Zhang Y. Evolution of phage display libraries for therapeutic antibody discovery. MAbs. 2023 Jan-Dec;15(1):2213793.

[2] Ledsgaard L, Kilstrup M, Karatt-Vellatt A, McCafferty J, Laustsen AH. Basics of Antibody Phage Display Technology. Toxins (Basel). 2018 Jun 9;10(6):236.

[3] Istomina PV, Gorchakov AA, Paoin C, Yamabhai M. Phage display for discovery of anticancer antibodies. N Biotechnol. 2024 Nov 25;83:205-218.