背景介绍 

基因定点突变是指通过实验手段在特定的DNA序列中引入预定的突变，从而能够研究基因调控元件、DNA-蛋白质相互作用、蛋白质结构/功能、酶活性位点和新蛋白质。这种突变可以是单个碱基的替换（点突变）、插入或缺失。与自然突变或随机突变不同，定点突变是有目的、有计划的，能够精确地改变基因的特定位置。

卡梅德生物（KMD Bioscience）提供基因定点突变服务，我们的技术专家可以针对任意的基因模板和任意数量的基因位点进行突变，从而将突变或改变的基因序列嵌入目标基因序列中。卡梅德生物提供的基因定点突变服务可以进行准确的突变DNA克隆，为客户缩短项目周期，节省成本。

基因点突变简介

定点突变的基本流程需要合成突变引物，其包含了目标突变，并且与突变位点附近的模板DNA互补以与目的基因的DNA 杂交。突变可以是一个碱基的改变（点突变），多个碱基的改变，增加或者删除。该引物接着被一个 DNA 聚合酶延展，拷贝剩下的基因。拷贝后的基因包含了突变位点，并以载体的形式引入宿主细胞，并被复制。最后，突变将通过 DNA 测序以确保包含了目标突变。

单点突变，指DNA序列中单个碱基的改变，这种改变可以是碱基的替换、插入或缺失。根据其对基因功能的影响，单点突变可以分为错义突变、同义突变、无义突变及插入缺失突变。

多位点突变是指在基因序列中同时引入多个突变位点，可通过分步单点突变和重叠延伸 PCR实现。分步单点突变，即是多次使用单点突变，每次针对一个突变位点设计引物进行 PCR 突变，然后以得到的含有一个突变的质粒为新的模板，进行下一个位点的突变。重叠延伸 PCR通过设计多对引物，将含有不同突变位点的 DNA 片段分别扩增，然后通过重叠延伸的方式将这些片段拼接在一起，形成含有多个突变位点的完整DNA序列。

图1.重叠延伸 PCR点突变示意图（参考：https://tjlab.ustc.edu.cn/2019/1114/c26226a506051/page.htm#2.1.11）

服务内容

服务流程

图1.突变流程示意图（参考：https://tjlab.ustc.edu.cn/2019/1114/c26226a506051/page.htm#2.1.11）

基因定点突变服务常见问题解答

1. 重组质粒转化至DH5α感受态细胞时，未能在突变筛选平板上获得阳性克隆的原因？

答：可能原因是使用的引物序列未能与目标DNA序列完全互补配对，建议重复进行钝化、激化及连接步骤以确保反应的完整性。

2. 基因点突变引物设计原则

答：设计互补引物，长度约25-45碱基，引物5'端含突变碱基，确保与模板DNA互补，特异性结合；通常以突变碱基为中心，两边序列至少11-12 bp。

3. 在基因定点诱变中必须使用 5`-磷酸化引物吗？

答：5'-磷酸化引物的主要作用是为后续的连接反应提供必要的磷酸基团。DNA连接酶（如T4 DNA连接酶）需要引物的5'端具有磷酸基团，才能将DNA片段连接起来形成环状质粒。是否需要使用5'-磷酸化引物取决于所采用的具体方法和试剂盒的设计原理。